研究背景及目的据报道,全球三分之一的死亡率归因于细菌感染,细菌感染可引起范围广泛的疾病,其中金黄色葡萄球菌是引起临床感染的主要细菌之一,其能够引起包括感染性心内膜炎、骨关节炎、皮肤和软组织炎症、肺炎以及器械感染在内的相关炎症。金黄色葡萄球菌具有较高的致病性,且极易产生耐药性,使得传统的抗菌疗法治疗效果不佳,极大增加了临床细菌感染类疾病治疗的难度。目前,传统的细菌感染类疾病的治疗方法仍然是以抗生素为主。虽然抗生素的出现挽救了大多数细菌感染病人的生命,但抗生素的广泛使用也极大增加了全球耐药菌的数量,而且耐药菌导致的感染给人类健康带来了更大的威胁。细菌产生耐药的机制多种多样,其中细菌细胞膜上外排泵的存在和细菌生物膜的形成是两个重要的因素。外排泵属于跨膜外排系统,能够排出细菌细胞中的有毒物质,Major facilitator superfamily（MFS）和 Multi-anfimicrobial extrusion（Mate）是多药耐药金黄色葡萄球菌两种主要的外排泵,它们能够通过离子势能的变化排出多药耐药菌摄入的有害物质。细菌生物膜（Bacterial biofilm,BF）是细菌为适应生存环境黏附于非生物或活性组织表面,并将自己包被在自身产生的黏液性不均一聚合基质中形成的一种与浮游细菌相对应方式生长的细菌群。BF的主要成分包括多糖细胞间粘附素（Polysaccharide intercellular adhesion,PIA）、胞外 DNA（Extracellular DNA,eDNA）及一些蛋白质等,其中,eDNA起支持生物膜结构的作用,PIA在生物膜中起着粘附作用。BF的形成建立了保护细菌免受外界压力的天然屏障。综上,BF和细菌外排泵的存在已经成为阻碍临床治疗细菌感染类疾病的重要因素,探索一种高效清除细菌又能降低细菌产生耐药性的抗菌策略是当前临床治疗感染类疾病的关键问题。近年来,研究人员已经开发了多种抗菌策略来治疗细菌感染,如金属纳米颗粒、阳离子聚合物、肽聚糖、纳米载体、光热疗法和光动力抗菌疗法（Antimicrobial photodynamic therapy,aPDT）等。光动力抗菌疗法是通过一定波长的光激发光敏剂（Photosensitizer,PS）产生活性氧（Reactive oxygen species,ROS）类物质来杀伤细菌的一种抗菌方法,其抗菌效果依赖于光、光敏剂和氧气三种因素的协同作用。aPDT的抗菌机制主要是基于光敏剂在被光照激发过程中产生的ROS的氧化损伤作用,ROS能够攻击细胞的多种靶点,包括膜、脂类、蛋白质和DNA,导致细胞质渗漏、降解和细胞死亡,从而达到抗菌效果。同时,ROS的非特异性靶点能够引起多种死亡信号通路,产生独立于抗生素耐药性的杀伤作用,使得细菌不易对aPDT产生抗性。此外,aPDT的重复使用具有高度的空间可控性,无累积毒性,优于传统的抗感染疗法。光敏剂是影响光动力抗菌效果的重要因素之一。研究表明,多数光敏剂都具有较好的抗菌效果,但仍存在一些不足,如,不易溶于水、易聚集,具有严重的副作用等。左卟吩钠（S-Porphinsodium,S-PS）是在HPPH基础上设计合成的一种新型光敏剂,属于二氢卟吩类物质,其成分单一,纯度高,且克服了 HPPH在生理环境中溶解度差的缺点,是一种理想的高水溶性、低暗毒性的光敏剂。已有文献报道了 S-PS介导的光动力疗法对胆管癌及乳腺癌具有显著的杀伤效果,但其在抗菌方面的研究还未见报道。因此,本论文主要研究了左卟吩钠介导的光动力抗菌疗法（S-PS-aPDT）在金黄色葡萄球菌、多药耐药金黄色葡萄球菌浮游菌和生物膜中的抗菌作用和生物学机制,以期为S-PS-aPDT在抗细菌感染中的临床应用提供数据。研究方法及结果第一部分 S-PS-aPDT对S.aureus/MDR S.aureus浮游菌的杀伤效应及机制探究实验首先测定了 S-PS在S.aureus/MDR S.aureus中的摄取情况以及S-PS的光毒性、暗毒性,并通过EPR和AFM研究了 S-PS-aPDT对S.aureus/MDR S.aureus浮游菌的杀伤效应及机制。结果表明:S-PS在S.aureus/MDR S.aureus中的富集量均在40 min时达到最大,且S-PS本身不产生毒性,但经过光照后能够对S.aureus/MDR S.aureus浮游菌产生显著的杀伤效果。此外,由于MDR S.aureus中外排泵的存在,MDR S.aureus对S-PS-aPDT的敏感度要远低于S.aureus,但在使用外排泵抑制剂后能够在一定程度上提高MDR S.aureus对S-PS-aPDT的敏感性。S-PS-aPDT能够通过产生ROS损伤细菌细胞壁/膜,使其内容物外漏,产生凹陷,从而杀死细菌。第二部分S-PS-aPDT对S.aureus/MDR S.aureus生物膜的杀伤效应及机制探究一定数量的浮游菌聚集后会逐渐形成细菌生物膜,为研究S-PS-aPDT对S.aureus/MDR S.aureus生物膜的杀伤效应及生物学机制,论文首先通过刚果红平板划线法研究了 S.aureus/MDR S.aureus的生物膜形成能力,并利用激光共聚焦显微镜观察了 S-PS在S.aureus/MDR S.aureus生物膜中富集的情况;在此基础上,研究了 S-PS-aPDT对细菌生物膜的杀伤作用,并利用RT-PCR检测了 S-PS-aPDT处理对S.aureus/MDR S.aureus生物膜相关基因ica操纵子表达量的变化。实验结果表明:在一定培养条件下,S.aureus/MDR S.aureus均有形成细菌生物膜的能力,CLSM观察发现,S-PS在S.aureus/MDR S.aureus生物膜中能够富集,并分别在2h和3h时富集量达到最大;平板涂布法和CLSM3D建模观察结果显示,S-PS-aPDT对生物膜有一定的杀伤效果,且在一定程度上可以损伤膜内的细菌。此外,S-PS-aPDT的处理能够显著抑制ica操纵子的表达和减少BF中PIA的含量。第三部分CMCS-OSA@DNase I&S-PS-liposome破坏MDR S.aureus生物膜增敏S-PS-aPDT为进一步提高S-PS-aPDT对MDR S.aureus生物膜的抗菌效果,实验设计合成了一种可降解细菌生物膜胞外基质的水凝胶来增强S-PS-aPDT抗菌效果。首先利用高碘酸钠（NaIO4）氧化海藻酸钠以实现水凝胶的可注射性和降解性,并通过碘量法测定其氧化度,选择氧化度最高的氧化海藻酸钠（Oxidized sodium alginate,OSA）与羧甲基壳聚糖（Carboxymethyl chitin,CMCS）进行不同比例的混合,检测其成胶时间、稳定性、可注射性及其降解性。在此基础上,向CMCS-OSA水凝胶中加入DNase I以及S-PS-liposome以检测该水凝胶37℃下在PBS中释放DNase I和S-PS-liposome的情况。结果表明:OSA的氧化度与NaIO4的投入量成正比,体积比为1:1的10%OSA与5%CMCS混合后形成的水凝胶具有快速成胶能力,并具有良好的可注射性和自降解性。CMCS-OSA@DNase I&S-PS-liposome具有持续释放DNase I的功能,在12h时DNase I的释放趋于平稳,达到60%左右的释放量。此外,DNase I的持续释放有效破坏了MDR S.aureus生物膜的结构,在与生物膜共孵育12 h后MDR S.aureus生物膜基本瓦解,细菌呈现出单个游离的状态,为后续aPDT抗细菌生物膜的研究奠定了基础。结论综上所述,论文对S-PS-aPDT对S.aureus&MDRS.aureus浮游菌和生物膜的抑菌效果及作用机制进行了研究,发现S-PS-aPDT对S.aureus/MDR S.aureus浮游菌和生物膜都有着较好的抑菌效果,S-PS光照后产生的活性氧是S-PS-aPDT抗菌的主要原因。此外,论文设计合成的CMCS-OSA@DNase I&S-PS-liposome能够有效地破坏MDR S.aureus生物膜的结构,使细菌生物膜瓦解暴露出膜内游离细菌,为后续将CMCS-OSA@DNase I&S-PS-liposome复合水凝胶与aPDT联合使用增强其抗菌效果奠定了基础。研究结果对推动S-PS-aPDT的临床应用提供了重要的理论依据和研究价值。