组蛋白的表观修饰(甲基化,乙酰化等)是表观遗传学研究的一部分,对于基因的表达调控具有重要的意义。在植物的生长发育以及植物拮抗生物和非生物胁迫过程中,组蛋白表观修饰基因起着重要的作用。在本课题中,我们研究了组蛋白去甲基化酶GmFLD和组蛋白去酰基化酶HDA6这两种抑制基因表达的组蛋白修饰因子在植物发育(开花)和生物逆境(病原侵染)反应中的功能,以探索组蛋白修饰因子在生命过程中起作用的分子机制。1.大豆GmFLD基因在拟南芥中可以促进植株开花在开花植物中,植物能在合适的时间开花,这对种子的成熟和后代的延续都是非常重要的。大豆是典型的短日照植物,植物开花调控的光周期途径和自主途径在大豆中都存在。大豆的全基因组测序结果公布以后,许多光周期途径的基因都陆续被克隆和研究,然而,关于大豆自主途径基因的研究,目前却鲜有报道。拟南芥FLD(Flowering LocusD)是开花调控自主途径中重要的基因。FLD基因编码一个LSDl(lysine-specific demethylase)类型的组蛋白去甲基化酶,它可以通过组蛋白H3K4去甲基化和H3/H4去乙酰化作用来抑制植物开花的核心抑制子FLC(FloweringLocusC)的表达。在拟南芥基因组中,FLD有两个同源基因:LSD1-LIKE1(LDL1)和LSD1-LIKE2(LDL2),这两个基因在抑制FLC基因表达方面与FLD存在部分的功能冗余。然而,LDL1和LDL2在沉默转录因子FWA(FLOWERING WAGENINGEN)方面的功能则与FLD无关。通过同源序列比对,我们发现大豆基因组中存在4个拟南芥FLD的同源基因(E值=0.0):LOC100786453(Glyma02g18610),LOC100810687(Glyma09g31770),LOC100783933(Glyma07g09980)和 LOC100809901(Glyma06g38600)。在氨基酸水平上,这四个基因与 FLD 的一致性分别为73%,57%,53%和52%。进一步通过反向比对、保守结构域分析、系统进化树分析,我们初步判定:LOC100786453(Glyma02g18610)为拟南芥FLD的同源基因,命名GmFLD;LOC100810687(Glyma09g31770)和 LOC100783933(Glyma07g09980)为拟南芥 LDL1 的同源基因,分别命名为 GmLDL1A 和 GmLDL1B;LOC100809901(Glyma06g38600)为 LDL2 的同源基因,命名为GmLDL2。本研究中,我们用遗传和分子生物学的方法分析了 GmFLD和GmLDL2在植物开花调控中的功能。GmFLD和GmLDL2在大豆中具有相似的组织表达模式:在子叶、根和果荚中表达量最高;在幼苗、下胚轴、上胚轴和花中的表达量较低;在单叶和三复叶的叶片中表达量最低。这与拟南芥中FLD和LDL2的表达模式并不完全一致。拟南芥中FLD和LDL2主要在根尖和茎尖表达。亚细胞定位分析显示GmFLD和GmLDL2均定位于细胞核中。在拟南芥(Col)中异源过表达GmFLD能够促进植物开花,并且GmFLD能够异位互补拟南芥ld突变体的晚花表型。我们的实验证明了相对于Col和fld突变体,在过表达GmFLD的转基因植株(Col和fld背景)中FLC的表达水平明显下降,FT和SOCI的表达量均显著上调。然而,过表达GmLDL2的拟南芥转基因植株并没有表现出开花相关的表型。染色质免疫共沉淀(ChIp)分析显示fld的互补植株中FLC基因转录起始位点处组蛋白H3K4me3(H3K4三甲基化)和H4Ac(H4乙酰化)的修饰水平均显著下调。这个结果表明GmFLD具有组蛋白去甲基化酶的功能。综上所述,我们的结果表明GmFLD是拟南芥FLD的功能同源基因,它在大豆中在调节染色质状态方面也可能起着重要的作用。我们目前的数据首次证明了在大豆中自主途径基因的进化保守性。2.拟南芥HDA6能够抑制病原反应相关基因的表达组蛋白去乙酰化酶(Histone deacetylases,HDAC)是一类在真核生物和原核生物中普遍存在的酶类,它可以去掉组蛋白赖氨酸上的乙酰基团使组蛋白更紧地缠绕着DNA。组蛋白去乙酰化酶在组蛋白修饰和基因表达调控方面都起着重要的作用。HDA6是组蛋白去乙酰化酶中的一员,它在植物的生长与发育和响应生物胁迫中起着重要作用。然而,仍然需要进一步的研究去揭示它全面的功能以及它在植物生长发育和响应生物和非生物胁迫过程中起作用的分子机制。在前期研究中我们实验室通过EMS诱变和图位克隆的方法鉴定到了一个新的拟南芥HDA6基因的突变体1502。在本课题的研究中,我们发现1502突变体呈现出多向性的表型:植株矮小,多数器官的体积也相应变小,如叶变小,角果变短等;植株开花时间延迟;花发育异常,雄蕊变短、花药远离柱头且开裂受阻,导致结实率下降;种皮颜色变黄,千粒重降低;1502突变体中的外源基因(Hygromycin抗性基因和Luciferase报告基因)的表达被激活。ChIP分析的结果显示,1502突变体中外源基因的组蛋白乙酰化修饰水平明显比野生型(9-1)的高。更有趣的是,1502突变体幼苗的子叶以及早期长出的莲座叶呈现类似病原超敏反应的表型,如黄化并逐渐死亡,这在前人鉴定的HDA6突变体中没有报道的。为了找到受HDA6调控的下游基因以分析HDA6的功能和解释1502突变体的表型,我们进行了转录组测序分析。转录组测序分析的结果显示:相对于野生型材料9-1,1502突变体中有329个基因的表达量上升,其中有66个基因的功能注释与生物逆境刺激(biotic stress stimulus)有关,包括17个与超敏反应相关基因,5个WRKY家族基因。我们进一步通过RT-PCR验证了这些基因的表达,RT-PCR的结果与转录组测序结果一致,且这些基因的表达在互补植株中都恢复到野生型的水平。然后,我们随机挑选了 8个超敏反应相关基因进行了 ChIP分析,结果显示:在突变体中,这些基因的转录起始位点附近区域的组蛋白酰基化水平均明显上升,说明这些表达量上调的超敏反应相关基因应该是HDA6乙酰化修饰作用的直接靶基因。病原菌侵染实验证实,相对于野生型材料9-1,1502突变体对病原菌(Pst DC3000)侵染的抗性增强,这表明HDA6负调节植物的防御反应,在非侵染条件下抑制病原反应相关基因的表达。