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DENN(Differentially Expressed in Normal cells and Neoplasia)结构域是进化上非常古老且高度保守的蛋白模块,其本身具有鸟苷酸交换因子(guanine nucleotide exchange factors,GEF)活性。研究表明,具有DENN结构域的蛋白常常作为Rab蛋白的GEF发挥作用,负责介导特定的Rab蛋白与GTP结合,使其变为激活构像,从而参与下游反应。Rab是已知最大的单体GTPase家族,通过效应蛋白调控细胞囊泡运输和细胞器稳态等多种功能。FAM45A是一种非经典型DENN家族蛋白,存在于阿米巴、海胆、多种昆虫和脊椎动物等多种真核生物体内且高度保守。我们前期研究表明,FAM45A是晚胞内体/多囊泡体的调节因子,调节晚胞内体的定位、成熟与分泌,但具体作用机制仍不明确。在本研究中,我们构建了多种Rab蛋白的GTP/GDP锁定突变体,利用免疫共沉淀和囊泡稳态功能学回补实验,发现FAM45A与多种Rab有相互作用,其敲降表型可被Rab27a/b的GTP锁定突变体回补,说明FAM45A处于Rab27a/b的上游。其次,我们通过联用免疫沉淀和质谱,鉴定发现了 FAM45A与另一囊泡转运调节蛋白复合物COMMD/CCDC22/CCDC93(CCC)有相互作用。最后,我们通过构建FAM45A、MADD双基因敲降细胞系,探讨了 FAM45A与另一 DENN家族蛋白MADD之间的功能相似性和相互作用。目的:研究FAM45A蛋白调控囊泡转运的作用机制方法:一、FAM45A蛋白的下游Rab鉴定1、构建3xFlag标记的FAM45A和各种带有Citrine标记的Rab蛋白,利用免疫共沉淀法研究FAM45A和Rab蛋白的相互作用;构建Rab蛋白的GTP结合锁定突变体和GDP结合锁定突变体,通过免疫共沉淀检测GTP结合锁定突变体和GDP结合锁定突变体与FAM45A的相互作用强度。2、构建稳定表达FAM45A shRNA的基因敲降细胞系,观察Cit-Rab蛋白的定位。以CD63(晚胞内体)的定位为表型,检验Rab GTP结合锁定蛋白对FAM45A缺失表型的回补能力;构建mCherry-FAM45A并将其和Citrine-Rab蛋白一起共转染到Hela细胞中,利用荧光显微技术观察其共定位情况。二、研究FAM45A的潜在相互作用蛋白1、联用免疫沉淀和质谱,鉴定FAM45A相互作用蛋白2、免疫共沉淀和荧光显微镜法验证质谱结果三、探究FAM45A与另一 DENN家族蛋白MADD的关系1、构建FAM45A/MADD基因双敲降细胞系2、研究FAM45A、MADD基因敲降对CD63定位、外泌体分泌的影响结果:一、FAM45A蛋白的下游Rab鉴定1、本次实验所用的Rab蛋白与FAM45A都有一定程度的相互作用,说明FAM45A有结合Rab蛋白的能力,但其特异性在体外实验中不明显;2、与GDP结合锁定突变体相比,FAM45A与Rab27a/b GTP结合锁定突变有更高的亲和力;3、成功构建稳定表达FAM45A shRNA的基因敲降细胞系,与之前实验室的表型一致;4、Cit-Rab27a/b蛋白在FAM45A基因敲降细胞系中向核聚集;5、Cit-Rab27a/b GTP锁定突变体可回补FAM45A基因敲降造成的表型;6、Cit-Rab27a/b 与 mCherry-FAM45A 存在共定位。二、研究FAM45A的潜在相互作用蛋白1、我们发现了与FAM45A与CCC蛋白复合体(由CCDC22、CCDC93和COMMD蛋白构成)相互作用;2、通过免疫共沉淀和荧光显微技术,验证了 FAM45A与CCDC22蛋白有相互作用且存在共定位。三、探究FAM45A与另一 DENN家族蛋白MADD的关系1、与FAM45A类似,MADD的缺失同样引起CD63向核聚集,也导致部分的外泌体释放缺陷;2、MADD基因敲降导致FAM45A mRNA上升,但FAM45A基因敲降并未导致MADD出现明显变化。结论:1、Rab27a/b与FAM45A存在核苷酸状态依赖的相互作用,且可以回补FAM45A缺失后的功能;2、FAM45A与CCC复合物存在相互作用;3、DENN家族另一蛋白MADD与FAM45A有类似功能。