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D-1,2,4-丁三醇（D-1,2,4-butanetriol,BT）是一种非天然生物合成化学品,应用于工业生产及生活中多个领域。目前为止,利用微生物代谢合成BT仍然依赖于外源基因的游离表达,其不稳定性对未来的工业应用存在潜在的不利影响,因此,本研究利用分子手段构建更稳定整合型BT合成菌株,敲除木糖分支代谢途径、弱化PTS系统、强化表达戊糖转运蛋白、阻断3,4-二羟基丁酸副产物途径,通过廉价乳糖诱导下共底物发酵合成BT,为后续放大研究提供借鉴。为构建整合型BT合成菌株并敲除木糖分支代谢途径,利用Red重组技术将外源基因kivD、xdh敲入到大肠杆菌木糖分支代谢途径关键基因xylAB位点,kivD、xdh酶活测定及PCR验证表明同时完成了整合与敲除,木糖转化为BT产量达到0.7 g·L-1,木糖转化率为0.12 mol·mol-1;为缓解重组菌在单一碳源条件下生长受限,添加5 g·L-1葡萄糖,菌体生物量提高了36%,但木糖代谢速率下降了33%,BT产量仅为0.59 g·L-1;为抑制上述CCR效应,实现木糖、葡萄糖共底物发酵,利用同样技术将kivD、xdh整合至ptsHI位点,对大肠杆菌进行增加拷贝数和PTS系统改造,产量最高可达2.8 g·L-1。为提高工程菌BT产量,研究强化戊糖转运蛋白提高木糖转运效率并阻断3,4-二羟基丁酸副产物代谢途径,通过过表达不同的戊糖转运蛋白基因,发现其中质子协同转运蛋白（XylE）的高效表达更有利于BT的合成,产量提高至4.37 g·L-1;重组菌已敲除木糖分支代谢途径的木糖异构酶、木酮糖激酶基因（xylA、xylB）和中间代谢产物2-酮-3-脱氧木糖酸（KDX）旁路代谢途径中的醛缩酶基因（yagE、yjhH）,为进一步提高主代谢途径碳通量,利用CRISPR-Cas9基因编辑技术敲除3,4-二羟基丁酸副产物途径,醛脱氢酶基因feaB缺失有效增强主代谢途径对碳流的竞争力及木糖的转化效率,使得BT产量提高了37%,进一步增加到6.0 g·L-1。为进一步提高BT产量和降低成本,优化底物糖浓度,并利用乳糖替代IPTG诱导外源基因的表达,结果表明:增加底物木糖、葡萄糖浓度有利于提高重组菌生物量及BT产量,经优化后达到6.8 g·L-1;利用无毒且价格低廉的乳糖替代IPTG诱导重组菌合成BT,并对乳糖浓度、诱导时机、诱导温度进行条件优化,BT产量可达到4.5 g·L-1,转化率为0.31 mol·mol-1;在5 L发酵罐中分批发酵重组菌,恒定的通气量及高搅拌转速有利于菌体的生长,与摇瓶发酵相比,生物量提高了38%,BT产量达到5.9 g·L-1。本论文产BT重组菌稳定性问题的解决及整合型工程菌共底物发酵等研究,为后续放大研究打下基础。