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鸭源性传染性支气管炎病毒ZZ2004(IBVZZ2004)是从以生长和免疫抑制为主要症状的病鸭体中分离到的一株病毒,对鸡和鸭均有致病性。本研究在已建立的RT-PCR和已完成全基因组序列测定的基础上,建立了 IBV ZZ2004的长距离RT-PCR方法,并构建全基因组cDNA文库,为进一步开展该病毒的反向遗传技术研究奠定了基础。依据IBV ZZ2004毒株的全基因组序列,针对20370nt～24541 nt设计了一对横跨S、3a、3b及E基因的特异性引物(F1/F2),利用具有3’-5’Exonuclease活性的耐热性DNA聚合酶,分别用2Step法和3Step法进行扩增,通过对引物浓度、退火温度、延伸时间等条件进行了优化。3Step法中以引物浓度为20pmol/μL、退火温度为61.0℃、循环30次为最佳反应条件;2Step法中以引物浓度为20pmol/μL、退火温度为68.0℃、延伸时间为3min、循环30次为最佳反应条件。两者相比,2Step法较3Step法简单快捷,因此,选择了 2Step法作为长距离RT-PCR的最合适的方法。通过长距离RT-PCR,扩增出了大小为4171bp的基因片段,与预期目的片段大小一致,成功建立了 IBV ZZ2004毒株的长距离RT-PCR方法。根据IBV ZZ2004毒株的全基因序列,借助DNA Star软件分析,选择全长基因组核苷酸序列中单一限制性酶切位点,设计合成引物13对,利用RT-PCR技术,成功地扩增出了覆盖ZZ2004毒株全基因组的13个cDNA重叠片段F1～F13,分别克隆到pMD-19T载体上,用JM109感受态细胞化学转化,得到了 13个不同的重组质粒;13个重组质粒经PCR鉴定和测序鉴定正确后,获得了一个包括13个cDNA片段的IBV ZZ2004毒株全基因组cDNA文库。另设计合成引物4对,利用建立的长距离RT-PCR方法,成功扩增出覆盖IBV ZZ2004毒株全基因组的4个cDNA重叠片段:N1(1 nt～5954 nt)、N2(5860nt～12491nt)、N3(12434nt～20930nt)、N4(20717nt～27673nt),分别克隆到 pGEM-T easy载体上,通过DH5α感受态细胞化学转化,得到了 4个不同的重组质粒;4个重组质粒经双酶切鉴定和测序鉴定正确后,获得了一个包括4个cDNA片段的IBV ZZ2004毒株全基因组cDNA文库;通过Bsp119I酶将N1片段和N2片段连接,通过Swal酶N3片段和N4片段连接,长度分别为12456bp和15217bp,将其克隆到pFastBacHTA载体上,形成了只有2个大片段的IBV ZZ2004毒株全基因组cDNA文库,为进一步构建全长cDNA奠定了基础。综上所述,本研究成功建立了 IBV ZZ2004毒株长距离RT-PCR方法,用长距离RT-PCR方法构建全基因组cDNA文库,所含cDNA分子群集个数少,更有利于快速构建全长cDNA分子,比用RT-PCR构建cDNA文库法更加方便快捷。