DrLEA3参与耐辐射奇球菌极端抗性机制研究

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耐辐射奇球菌对于干旱、高盐、氧化压力等环境胁迫具有极高的耐受性。基于生物响应辐射与干旱胁迫的共通之处,目前的研究认为耐辐射奇球菌的超强辐射抗性可能源自其对于干旱环境的适应。本论文以耐辐射奇球菌中干旱胁迫相关基因dr1172及其编码蛋白DrLEA3为对象,研究其家族分类以及体内外的功能(如维持细胞膜的稳定、蛋白及酶活保护、金属离子结合与抗氧化等),主要研究结果如下:1、生物信息学的实验结果表明DrLEA3是一个典型的3型LEA家族蛋白,其具有奇球菌属(Deinococcus-)内保守的N端结构域以及高度疏水的C端区域,其中散布有LEA家族蛋白的标志性11个氨基酸的重复序列。这些重复序列的6,7,8号位点严格保守(Lys-Asp-Lys),其余的位置则具有较高的特定氨基酸(Ala,Val,Asp)出现频率,表明其在进化上并不完全保守。2、通过比较野生型与dr1172突变株的生长曲线和过氧化氢等胁迫的表型,我们发现该基因的缺失会造成细胞生长的减缓以及氧化胁迫耐受性的降低,但对于UV胁迫不敏感。实时定量PCR实验结果表明在细胞受到高盐和高剂量过氧化氢胁迫的条件下,dr1172的基因表达发生上调,然而其在紫外胁迫的条件下则没有发生明显的变化,表明DrLEA3蛋白主要参与了细胞的氧化胁迫响应过程。此外,我们检测了野生型和dr1172突变株细胞的总抗氧化酶活性以及3种主要的氧化还原酶(SodA,KatE,KatA)的酶活以及编码基因的转录水平。实验结果表明dr1172突变株细胞的总抗氧化能力和SodA的转录水平及酶活相较于野生型细胞均降低。然而有意思的是dr1172突变株中katE和katA的转录水平和氧化还原酶活性的变化却不一致:转录下调的katE伴随着升高的KatE氧化还原酶活性,转录上调的katA则有着较低的KatA氧化还原酶活性。这些实验结果表明DrLEA3蛋白可能以一种独特的方式参与了这些氧化还原酶的调控过程。3、相较于野生型菌株,dr1172突变株的胞内金属离子含量检测表明三种金属离子(Mn,Fe,Zn)的浓度都发生了显著性的下降,其中Mn离子的下降幅度较大,这导致了突变株较野生型菌株的胞内Mn/Fe比的降低,表明DrLEA3蛋白可能起到了维持耐辐射奇球菌胞内金属离子平衡的作用。ICP-MS实验结果表明纯化后的DrLEA3蛋白能够结合这些金属离子,并通过其改变蛋白质的二级结构组分。亚细胞定位显示DrLEA3蛋白主要分布于细胞质和细胞膜上,表明其有可能通过与细胞膜以及相关金属转运蛋白的相互作用,维持胞内金属离子的动态平衡。综上所述,本研究结果表明耐辐射奇球菌DrLEA3蛋白是一个属内保守的3型LEA家族蛋白,其参与了细胞对于氧化胁迫的响应。同时DrLEA3蛋白主要定位于细胞膜上,且能够结合特定的金属离子,维持了细胞内Mn,Fe等金属离子的动态平衡。这些研究为耐辐射奇球菌的极端抗性,特别是氧化抗性机制研究提供了线索和新的思路。
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