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腭裂是一种常见的出生缺陷,发病机制尚未明确,可能与腭突中嵴缝降解受阻导致两侧腭突融合失败有关。因此,腭突中嵴上皮细胞的正常转归对于腭突融合至关重要。全反式维甲酸(all-trans retinoic acid, atRA)是维生素A的一种体内氧化代谢产物,能够调节哺乳动物胚胎的生长发育。然而,atRA过量或缺乏均有致畸作用,如：诱发腭裂、神经管畸形等。转化生长因子-p(transforming growth factor-β, TGF-β)是一种细胞因子,主要通过Smad蛋白将信号分子传递到细胞核内,调节目的基因转录。研究表明,atRA可调节TGF-p在多种组织器官中的表达,但是否影响Smad蛋白在腭组织中的表达,至今尚未明确。目的通过细胞划痕实验观察过量atRA对腭突中嵴上皮细胞迁移的影响。通过组织形态学,末端脱氧核糖核酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记技术(TUNEL技术)、免疫组化和Western blot方法,探讨过量atRA对腭突融合、中嵴上皮细胞凋亡、层粘连蛋白和Smad蛋白表达的影响。方法以10周龄昆明小鼠按雌雄比例2：1合笼,次晨检到阴栓者记录为妊娠天数(gestation day, GD)0,以GD13孕鼠之胎鼠为研究对象。将1只GD13孕鼠处死,分离出全部胎鼠腭突,以中性蛋白酶分离腭突中嵴上皮,继以胰酶消化后,用含10%胎牛血清的DMEM/F-12培养基调整细胞浓度为5×105个/ml,5ml接种于25ml培养瓶中,CO2培养箱中培养96h。以同样细胞浓度接种于6孔板中,各孔2m1,同样条件下培养24h。弃去原培养基,在各孔贴壁细胞层以20μl加样器头平行于培养板长轴划出一条划痕带,其中3孔添加含5μmol/L atRA的DMEM/F-12培养基(不含血清),剩余3孔添加不含血清的培养基,每孔2ml,继续原条件培养72h,观察过量atRA对腭突中嵴上皮细胞迁移的影响并与对照组比较。将2只GD13孕鼠处死,分离得到24对胎鼠腭突。取12对腭突分别设为对照组和1μmol/L、5mol/L、10μmol/LatRA实验组,每组3对,转移到Grobstein器官培养皿中,各分组中加入相应浓度atRA的BGJb培养基10ml,对照组只加培养基10ml, CO2培养箱中培养72h。将所有腭板固定、石蜡包埋、切片。将各组所有切片做HE染色,观察不同浓度atRA对腭板融合的影响。取6对腭突分别设为5nmol/L atRA实验组和对照组,每组3对,同样条件下培养72h,所有腭板经固定、包埋和切片后,进行免疫双标记检测,观察过量atRA对腭突中嵴上皮细胞凋亡以及基底膜层粘连蛋白表达的影响。剩余6对腭突分别设为5μmol/L实验组和对照组,每组3对,同样条件下培养24h,分别取两组腭板中央宽约1mm的腭上皮组织,运用Western blot方法检测过量atRA对磷酸化Smad2、3和Smad7表达的影响并与对照组比较。结果培养的原代腭突中嵴上皮细胞贴壁生长,多角形或卵圆形,成片生长：当细胞融合率>80%,呈现铺路石状外观。在培养过程中,对照组划痕逐渐弥合,培养72h,爬行细胞几乎覆盖整个划痕带；而atRA实验组未见到向划痕区迁移的细胞,划痕宽度没有改变。HE染色显示对照组两侧腭板完全融合；而1μmol/L、5μmoI/L atRA实验组腭板中央中嵴上皮缝清晰可见,10μmol/LatRA实验组两侧腭突未发生接触。免疫组化染色可见对照组基底膜层粘连蛋白表达不完整,而5μmol/L atRA实验组层粘连蛋白强阳性连续表达。TUNEL检测显示对照组在中嵴缝位置处及口腔鼻腔上皮三角形区域内出现凋亡细胞；而5μmol/L atRA实验组相应区域未看到凋亡细胞。Western blot结果显示与对照组相比较,5μmol/L atRA实验组磷酸化Smad2、3低表达,而Smad7高表达。结论在腭突中嵴上皮缝降解过程中,腭突中嵴上皮细胞既有迁移现象也存在凋亡,其转归方式受到干扰,均可抑制双侧腭板融合,诱发腭裂。过量atRA抑制腭突中嵴上皮细胞迁移和凋亡,并抑制中嵴缝基底膜的降解,从而阻止双侧腭板融合,并诱发腭裂。过量atRA可能通过改变Smad的表达而干扰腭突中嵴上皮细胞正常凋亡