温度和蓝光对红曲霉莫纳可林K代谢调控的影响

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红曲霉次生代谢产物中的莫纳可林K(Monacolin K)是有效的胆固醇合成抑制剂,而其产率普遍不高和红曲霉代谢产物中桔霉素的存在,限制了红曲产品的开发与应用。红曲霉的次生代谢产物受温度、光照、pH、溶氧量等环境因子的影响。本文主要研究了温度和蓝光对红曲霉发酵过程中莫纳可林K产量的影响,并采用RT-qPCR技术对莫纳可林K相关合成基因的表达情况进行分析,探讨莫纳可林K代谢调控的机理;对功能红曲菌株的产桔霉素特性进行安全性评价,为构建高产莫纳可林K不产桔霉素的基因工程菌提供依据。采用固态发酵方式,研究不同温度对高产莫纳可林K的红曲霉MC2菌株发酵过程中莫纳可林K产量的影响。结果显示,在30-C条件下培养到第25 d时莫纳可林K产量达到21.2 μg/g干重;在20-C条件下培养到第28 d时莫纳可林K产量达到2917.7μg/g干重,两者相差137倍。采用液态静置发酵方式,研究蓝光对莫纳可林K产量的影响,结果发现,蓝光和黑暗条件均在第28 d产量达到最高,分别为519.5 μg/g干重和1213.4 μg/g干重。蓝光照射培养条件下,莫纳可林K的最高产量仅为黑暗培养条件下的43%。设计引物,克隆红曲霉MC2基因组DNA中与莫纳可林K合成相关的10个基因的部分片段,将PCR产物测序结果与NCBI上报道的桔霉素合成相关基因序列进行BLAST比对,结果显示,同源性均在99%以上。采用RT-qPCR方法,比较30℃与20℃条件下,以糯糙米为基质,在发酵过程中红曲霉MC2菌株的莫纳可林K合成相关基因表达量的差异,结果表明:低温条件提高了mokA、mokC、mokD、mokE、mokF、mokG和MpLaeA的表达量,降低了mokB、mokH和mokI基因的表达量。采用RT-qPCR方法,比较蓝光和黑暗培养条件下,莫纳可林K合成相关基因表达量的差异,发现蓝光照射培养条件下,除mokB外,所有与红曲霉MC2菌株莫纳可林K合成相关基因的表达量均低于黑暗培养条件,从而导致蓝光下莫纳可林K产量降低,其中mokA、mokC、mokD、mokE、mokG是莫纳可林K合成过程中九酮化合物合成途径中的相关基因,温度和蓝光都是通过影响莫纳可林K九酮化合物的合成来影响莫纳可林K的最终产量。分析了红曲霉MC2、C100和M9菌株在不同培养基中的产桔霉素情况,发现红曲霉MC2是一株不产桔霉素的菌株,该菌株缺少桔霉素合成的关键基因ctnA、pksCT和orf3。对红曲霉C100和M9两株正常产桔霉素菌株进行培养,发现在添加一定量NH4NO3的大米粉培养基中不产桔霉素,利用RT-PCR方法分析不产桔霉素时相关基因的表达情况,发现桔霉素合成基因簇中相关基因均有表达。
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