第一部分人cfsRNA的提取及含量、种类、来源分析目的：建立提取cfsRNA的有效方法,了解其含量、种类、来源。为进一步探索cfsRNA的临床应用价值及存在意义奠定基础。方法：收集精液参数正常的男性精液标本,联合应用Trizol LS Reagent和RNeasy Kit提取和纯化cfsRNA, RT-qPCR扩增管家基因β-actin (ACTB)比较纯化前后RNA提取效果,建立稳定的提取纯化技术,RT-qPCR扩增ACTB分析精液参数正常男性cfsRNA含量,并通过琼脂糖凝胶电泳和Agilent 2100 Bioanalyze (Lab on chip)的双重检测,验证cfsRNA质量及种类。用Affymetrix公司的Human Gene 1.0ST Array,分析精液参数正常的男性cfsRNA的mRNA种类及来源。结果：联合应用Trizol LS Reagent和RNeasy Kit提取和纯化的cfsRNA,用于荧光定量RT-PCR所得到的ct值比不纯化所提取cfsRNA明显提前,差异有显著性意义(P<0.01)。对10例精液参数正常标本分析,cfsRNA含量范围为每毫升精浆0.87μg到3.64μg,RNA分子完整性指数RIN (RNA Integrity Number)为6.4。28S与18S倒置,比值为0.6。Agilent 2100 Bioanalyze的结果分析说明cfsRNA可能种类繁多,包括28S rRNA,18S rRNA和小分子RNA(如5S rRNA, tRNA, microRNA等)及在这一范围间大量存在的大小不等的mRNA分子。cfsRNA芯片分析结果共20106种转录子存在,已知基因14,575个,其中12,089为已知基因,并有基因表达信息,其余为假基因、未知功能转录、小RNA等。芯片结果表达信息提示cfsRNA来源于多个男性生殖器官,其中前列腺表达而睾丸不表达2,009个,睾丸表达而前列腺部表达1,529个,前列腺和睾丸均表达2,518个,其余6,033个不在睾丸和前列腺中表达。结论：联合应用Trizol LS Reagent和RNeasy Kit可获得大量cfsRNA,能应用于microay、northern-blot、RT-PCR等技术。cfs-mRNA种类繁多,来源于多个男性生殖器官。可能成为精浆来源器官某些疾病(如肿瘤、基因表达异常所致疾病等)的无创性诊断、性犯罪法医鉴定等方面的新分子标志物。第二部分人cfs-m RNA一般特性分析实验一人cfs-m RNA完整性及稳定性分析目的：考虑到上述应用前景和优势,研究cfs-mRNA的一般特性是否满足分子检测技术的基本要求。本部分主要是研究精液正常男性cfs-mRNA的完整性、稳定性、是否与其他物质结合存在。本部分的完成将为进一步研究病理情况下cfs-mRNA及其应用研究奠定严谨的实验基础。方法：本部分采用分析mRNA的完整性的公认的方法,即针对mRNA不同部位：分别设计可扩增全长及针对5’端、3’端及中段片段的引物,收集精液参数正常的精浆标本9例,通过RT-qPCR的方法定量比较ACTB、DDX4 mRNA各自5’端、3’端及中段片段的量的差异,以转录子5’端为1,分析其3’端及中段相对5’端的比例,从而反映mRNA的完整性。在室温下静置,分别于0 min、20 min、45 min、90 min及24 h取出400μl精浆,提取cfsRNA,荧光定量RT-PCR检测入ACTB、DDX4 mRNA不同片段的量变及大鼠ACTB mRNA的量变规律。为分析cfsRNA是否以与大分子结合形式存在而逃避精浆RNA酶的降解作用,精液参数正常男性精浆标本分别通过直径分别是5.0μm、0.45μm、0.22μm的滤膜分别过滤,运用荧光定量RT-PCR观察过滤前后ACTB、DDX4 mRNA的量变规律。由于Triton X-100可以分解大分子结合物质,我们收集5人精浆,分为两等份,一份加TritonX-100(终浓度为10 ml/L)以分解蛋白质、脂类等物质,室温下静置20 min,另一份在提取RNA时加入TRIzol LS后加入,分别于0、5、10、20 min时取400μl精浆,荧光定量RT-PCR分析精浆ACTB、DDX4 mRNA的量变规律。结果：相对于ACTB mRNA的5’端,其中段片段的相对量为71%(P<0.05),3’端片段的相对量减少到24.2%(P<0.001)。相对于DDX4 mRNA的5’端(100%),其中段片段的相对量为48.4%(P<0.05),其3’端片段的相对量减少到2.0%(P<0.001)。结果说明cfs-mRNA可能主要以片段形式存在,而主要可能从mRNA3’端开始降解。精浆在室温下静置不同时间后,较0 min时间ACTB mRNA的量,ACTB mRNA的5’端、3’端及中段在24 h内均无明显减少(P>0.05),说明ACTB mRNA是稳定的。DDX4 mRNA的5’端在24 h内稳定(P>0.05),而DDX4 mRNA中段的含量在90 min时开始慢慢减少,24 h后已经降解到最初的25.8%(P<0.01,)3’端含量在20 min已降到了27.4%,90 min时已检测不到(P<0.001)。精浆通过5.0μm的滤膜,与未过滤组比较,5.0μm的滤膜对ACTB、DDX4 mRNA水平均无影响,表明没有残余细胞的影响。而与未过滤组比较,通过0.45μm、0.22μm的滤膜后ACTB mRNA分别减少到55.2%和27.2%,DDX4mRNA分别减少到56.0%和39.4%(P＜0.05),说明精浆过滤后cfs-mRNA减少可能主要是与大分子结合存在。为进一步证实cfs-mRNA稳定性与复合物结合有关,我们向精浆标本中加入Triton X-100, cfs-mRNA稳定性明显下降,在室温条件下处理10min,20 min后,ACTB mRNA5’端水平下降到6.1%和2.3%,DDX4mRNA5’端水平10min后已检测不到。说明RNA-分子复合物结合是cfs-mRNA稳定存在与精浆中的关键机制。结论：精浆中有完整的cfs-mRNA存在,但主要以片段形式存在,且可能从mRNA3’端开始降解。cfs-mRNA可能是以与大分子物质形成复合物而存在于精浆中,尽管cfsRNA在精浆中相对稳定,但我们建议后续的研究或临床应用中为保证更好的cfsRNA质量,获得精浆标本后应立即放置液氮或-80℃保存,尤其是要对3’端分析时。实验二人cfs-mRNA存在形式研究目的：由于cfsRNA大量存在于精浆中,且精浆小体(seminal microparticles, SMPs)已被证实是稳定且大量的精浆物质之一。我们推测cfsRNA可能存在于来自不同男性生殖器官来源的SMPs中,后者是保护游离保护游离RNA不被环境中RNA酶降解的物质。方法：精液标本选自精液参数正常的男性及严重少精子症患者。分离SMPs并通过透射电镜观察形态,为获得包裹在SMPs内的cfsRNA,分别将RNA酶A加入从15例精液参数正常男性及10例严重少精子患者分离得到的SMPs重悬液中,浓度为100μg/ml,37℃水浴15 min,以去除SMPs表面或是裸露存在的cfsRNA。继续加入0.25%的胰酶37℃水浴15 min以分解SMPs外的RNA-蛋白质复合物。分离纯化以SMPs形式存在的cfsRNA,选择管家基因及男性生殖系统特异mRNA指标进行RT-PCR扩增,分析SMPs内是否存在cfsRNA以及相应比例。由于SMPs大小为直径30 nm-1.0μm之间,将6例精液参数正常男性的SMPs重悬液分为过滤组及未过滤组,过滤组分别通过直径分别是0.8μm、0.45μm、0.22μm及0.10μm的滤膜,运用荧光定量RT-PCR,观察与未过滤组比较,过滤不同孔径滤SMPs内cfsRNA的量变规律。结果：SMPs悬液的透射电镜观察显示为圆形或椭圆形微小结构,大小不等,可成簇分布。在精液参考值正常男性cfsRNA及其SMPs形式(smpRNA)中,六个基因：ACTB, DDX4, PRM2, DEFB129, SERPINA5及TGM4的检出率均为100%。对于精液正常男性及严重少精子症患者,比较总cfsRNA与SMPs形式存在的cfsRNA的量,ACTB, DDX4, PRM2, DEFB129,SERPINA5和TGM4 mRNA水平无明显的降低,说明绝大多数cfsRNA以SMPs形式存在,足以稳定被检出。由于SMPs大小为直径30nm-1.0μm之间,精浆通过0.8μm、0.45μm、0.22μm及0.10μm的滤膜后不同基因cfsRNA含量都有一定程度减少(P<0.01)。结论：精液参数正常男性及严重少精子症患者却大部分cfsRNA存在于SMPs中,从而保护不被精浆RNA酶降解,是潜在的诊断疾病的新分子标志物。这一形式的RNA物质是否也可以通过融合进入精子细胞发挥功能,有待进一步研究。第三部分小鼠附睾特异性mRNAs通过附睾小体递入精子的研究目的：本部分首先通过RT-qPCR定量附睾游离mRNA在附睾小体中的含量,参考文献选择并用RT-PCR证实小鼠附睾尾部表达而附睾头部区域不特异性表达基因：Crisp1。通过体外实验观察Crisp1 mRNAs是否存在于附睾小体中,并能通过附睾小体进入附睾头部精子。方法：取10-12周龄BALB/c雄性小鼠双侧附睾头、尾部,分离精子及附睾小体。将附睾上清液分成两份,分别用于提取附睾游离RNA (cfeRNA)和附睾小体RNA,用RT-qPCR,通过分析附睾特异性表达基因：Adam 7、Crisp1、Wfdc2、Wfdc9、Defb22,定量比较附睾游离mRNA和附睾小体中的mRNA含量。将超高速离心法获得的附睾尾部小体与附睾头部精子用PBS液37"C共孵育1 h,通过RT-PCR检测附睾尾部Crisp1mRNAs是否在孵育后的附睾头部精子中检测到,同时,以附睾头部末孵育的精子为阴性对照,以附睾尾部精子为阳性对照组。通过原位杂交-免疫电镜观察附睾尾部小体递入Crisp1mRNAs的定位。结果：RT-qPCR定量分析附睾游离Adam7、Crisp1、Wfdc2、Wfdc9、Defb22 mRNA在附睾小体中的比例，结果显示附睾小体内mRNA与游离形式mRNA水平无明显差异；通过RT-PCR的方法,分别在小鼠附睾头、尾小体中发现附睾头部小体不含Crisp1mRNA,主要在附睾尾部小体表达,推测附睾尾部上皮区域特异性表达Crisp1mRNA。分别观察小鼠附睾头、尾精子,发现附睾头部精子不含Crisp1mRNA,主要在附睾尾部精子中表达。附睾头部精子与附睾体尾部小体孵育后,可检测到Crisp1mRNA,主要表达于顶体及尾部中段,其胞浆小滴未消失,与附睾尾部精子中的定位一致。透射电镜分析结果表明附睾头部精子与附睾尾部小体孵育前,无明显胶体金颗粒存在,说明Crisp1mRNA不表达。而将附睾头部精子与附睾尾部小体孵育后,可见胶体金颗粒大小在10-20nm,主要分布于顶体,尾部主段及线粒体。结论：由于精子离开睾丸后转录被抑制,精子在附睾尾部获得附睾上皮区域特异性Crisp1mRNA。表明附睾游离mRNA可通过附睾小体递入精子。