BCG膀胱灌注是治疗膀胱肿瘤防止其复发最有效的方法之一，BCG联合IL-2治疗膀胱肿瘤具有更好的临床疗效。但目前临床应用存在给药量大、次数多、易导致结核播散等一系列并发症。耻垢分枝杆菌来源于土壤，与BCG相比，具有生长快、非致病性的特点。近年来，随着分子生物学和基因工程研究方法的不断发展，重组分枝杆菌技术使我们可以通过改变分枝杆菌的生物学特性(如分泌细胞因子)来调节和发挥分枝杆菌的免疫调节能力，克服BCG临床应用的缺陷，为进一步防治膀胱肿瘤的复发开辟了新的途径。 本研究分三个部分，首先构建了分枝杆菌-大肠杆菌穿梭分泌表达载体，并将人IL-2 cDNA克隆入该载体中表达，筛选稳定表达的重组分枝杆菌；然后将此菌株腹腔注射免疫小鼠，观察其增强小鼠免疫功能的作用以及在小鼠体内的稳定性及毒副作用，同时将重组菌作用于膀胱肿瘤细胞株，了解其体外抗肿瘤细胞增殖作用及效应细胞的抗肿瘤活性，观察其对膀胱肿瘤细胞生物学特性的影响；最后利用可移植性鼠膀胱肿瘤模型，观察重组分枝杆菌体内对肿瘤的治疗作用以及对荷瘤小鼠局部免疫功能的影响，探讨其体内的治疗效果及作用机制。主要研究内容和结果如下： 1．首先，利用hsp70启动子作为M.smegmatis中调控外源性基因表达的启动子，同时PCR扩增堪萨斯分枝杆菌α抗原信号肽基因，利用α抗原信号肽基因作为M.smegmatis中外源性基因分泌表达的信号肽，并将人IL-2 cDNA克隆入分枝杆菌载体pRR3中，构建成分枝杆菌-大肠杆菌穿梭分泌表达载体pR-α-IL-2。酶切鉴定及测序结果表明启动子、信号肽及目的基因连接正确，穿梭表达载体pR-α-IL-2构建成功。 2．将此载体利用电穿孔的方法导入耻垢分枝杆菌中，通过限制性酶切分析、DNA测序及IL-2功能性产物的活性分析，确定重组分枝杆菌疫苗株的正确性，并对其体外稳定性进行了研究。Western blot及MTT法检测证明重组分枝杆菌可以分泌外源性IL一2，培养上清的IL一2活性为118.5U/m!。体外稳定性研究结果表明在有卡那霉素抗性存在的情况下，重组分枝杆菌在体外具有高度稳定性，在无选择性压力情况下可连续传代20次左右而不发生质粒丢失。体外应用分枝杆菌空菌、含空质粒分枝杆菌和重组分枝杆菌直接作用于膀肤肿瘤细胞株，显示三种分枝杆菌在体外均有抗肿瘤细胞增殖的活性，其中重组分枝杆菌活性最强。将三种分枝杆菌在体外诱导的SMAK细胞与LAK细胞分别作用膀肤肿瘤细胞株，结果表明:重组的分枝杆菌所诱导的SMAK细胞和LAK细胞在体外对膀胧肿瘤细胞的杀伤活性均较高，两者相比杀伤活性无明显差异。利用光镜和透射电镜分别观察重组分枝杆菌作用后膀肤肿瘤细胞大体结构和超微结构的改变，结果发现重组分枝杆菌作用后光镜下瘤细胞呈生长减慢、脱壁、数量减少、死亡的表现过程。透射电镜观察发现作用后多数细胞呈不同程度的退行性变，主要表现为细胞器结构破坏，核染色质聚集，核仁固缩，部分胞质溶解，核碎裂，胞膜破裂，细胞器逸出。利用流式细胞术测定分枝杆菌空菌、含空质粒分枝杆菌和重组分枝杆菌作用后膀肤肿瘤细胞(EJ、BTT739)HLD一DR、ICAM一1表达，结果表明所有分枝杆菌均可诱导或上调HLD一DR、ICAM一1的表达，其中重组的分枝杆菌组HLD一DR、ICAM一1表达最高。以上结果说明重组的分枝杆菌具有较强免疫调节的作用，在体外显示出一定的抗肿瘤增殖活性和细胞毒活性，同时具有增强机体对肿瘤细胞的识别效应的作用。应用重组分枝杆菌腹腔注射免疫Babl/c小鼠后，显示重组菌可较稳定地侵入定居于腹膜淋巴结、脾脏和肝脏，接种后16周机体可以有效的清除细菌，并且无明显的毒副作用，同时重组菌还可以诱导小鼠脾细胞产生分枝杆菌抗原特异性的细胞因子分泌，刺激脾细胞的增殖，增强小鼠T细胞免疫活性。将重组分枝杆菌疫苗株对荷瘤鼠进行瘤内注射，研究重组分枝杆菌疫苗株对可移植性鼠膀肤肿瘤抑瘤作用。经过3周内5次给药，空菌显示了一定的抗肿瘤作用，而重组分枝杆菌则显示出较强的抗肿瘤形成的作用。免疫组织化学结果表明，重组分枝杆菌作用后，瘤内CD3、CD4、CDS、CD56阳性表达均增强。 上述研究结果第一次阐述了耻垢分枝杆菌和重组分枝杆菌体内外抗膀肤肿瘤活性，对重组分枝杆菌的表达、体内外抗瘤活性及机制进行了研究，为进一步研究开发分枝杆菌新型疫苗，降低BCG的副作用，提高膀肤肿瘤的防治水平提供了理论和实验依据。