背景卵巢癌目前仍是全球妇科肿瘤死亡的主要原因,由于缺乏更有效的早期诊断方法及高复发率和化疗耐药,大多数卵巢癌患者仍然预后较差。因此,探究卵巢癌发生发展的作用机制进而发现更有效的卵巢癌靶点迫在眉睫。最近的研究表明,单纯研究肿瘤细胞本身不能解释肿瘤中的很多现象,所以肿瘤微环境这一概念在肿瘤的研究中越来越受到关注。除了肿瘤细胞,肿瘤微环境还主要包括细胞外基质,肿瘤相关成纤维细胞（CAFs）,广泛的血管网和免疫相关细胞等。研究发现,肿瘤细胞需要与其他细胞尤其是肿瘤相关成纤维细胞相互作用才能促进肿瘤的进展。由于外泌体能稳定携带mi RNA、lnc RNA、蛋白分子等物质使其在肿瘤微环境中不易被降解,所以外泌体在肿瘤细胞和其他细胞之间进行相互作用的过程中占据十分关键的地位。COL5A2属于胶原蛋白家族,是肿瘤微环境中细胞外基质的重要组成部分,在多种肿瘤的蛋白组学和数据库分析中发现其在肿瘤中高表达,并且与肿瘤的不良预后密切相关。因此,COL5A2可能是肿瘤治疗的潜在靶点。但是目前对于COL5A2的研究还主要集中于临床样本的检测上,其在肿瘤中的具体作用机制尚不明确。且在肿瘤微环境中,胶原蛋白与肿瘤相关成纤维细胞密切相关,所以以COL5A2为核心,阐明在卵巢肿瘤微环境中卵巢癌细胞和卵巢肿瘤相关成纤维细胞相互作用的具体机制能为开发卵巢癌新的治疗策略提供理论基础。目的本研究旨在探究COL5A2在卵巢肿瘤微环境中的表达情况和主要细胞来源,并以外泌体为切入点,探究COL5A2在卵巢肿瘤微环境中表达变化的具体调控机制。同时,明确在卵巢肿瘤微环境中COL5A2的表达变化对卵巢癌进展的影响和具体作用机制。方法1.COL5A2在卵巢肿瘤微环境中表达变化的机制（1）通过收集正常卵巢组织和卵巢癌组织进行COL5A2的免疫组化染色检测COL5A2在卵巢癌中的表达情况,并通过Kaplan-Meier Plotter数据库分析COL5A2与卵巢癌预后的相关性。（2）通过人蛋白图谱数据库分析COL5A2的主要细胞来源。收集正常卵巢组织和卵巢癌组织进行Masson染色和α-SMA的免疫组化染色检测卵巢癌中胶原沉积和肿瘤相关成纤维细胞的关系。用胶原酶消化法提取原代人源卵巢肿瘤相关成纤维细胞,并通过Western blot,细胞免疫荧光实验和光学显微镜对提取的原代人源卵巢肿瘤相关成纤维细胞进行鉴定。通过Western blot、q RT-PCR、ELISA实验检测原代人源卵巢肿瘤相关成纤维细胞和卵巢癌细胞系ES-2、SKOV3细胞的COL5A2蛋白、m RNA的表达量和COL5A2蛋白的分泌量,研究COL5A2在卵巢肿瘤微环境中的主要细胞来源。（3）分别将卵巢癌细胞系ES-2、SKOV3细胞上清和用外泌体抑制剂GW4869处理后的卵巢癌细胞系ES-2、SKOV3细胞上清与CAFs共孵育,通过Western blot、q RT-PCR、ELISA实验检测COL5A2蛋白、m RNA的表达量和COL5A2蛋白的分泌量。（4）超速离心法提取卵巢癌细胞外泌体,并通过电镜、Western blot和动态光散射实验对提取的外泌体进行鉴定。将提取的卵巢癌细胞外泌体与CAFs共孵育,通过Western blot、q RT-PCR、ELISA、细胞胶原收缩实验研究卵巢癌细胞外泌体对CAFs活化功能的影响以及对CAFs表达和分泌COL5A2蛋白量的影响。（5）通过生物信息学分析筛选出调控COL5A2的蛋白分子ITGB1。并通过慢病毒转染构建敲低ITGB1的稳转细胞系。分别提取卵巢癌细胞外泌体和敲低ITGB1后的卵巢癌细胞外泌体,与CAFs共孵育,通过Western blot、q RT-PCR、ELISA、细胞胶原收缩实验研究卵巢癌细胞外泌体中携带的ITGB1对CAFs活化功能的影响以及对CAFs表达和分泌COL5A2蛋白量的影响。2.COL5A2对卵巢癌增殖,迁移和侵袭能力影响的机制（1）通过建立裸鼠皮下种瘤模型和腹腔种植转移模型,检测肿瘤大小、质量、绘制生长曲线、计算Ki67阳性率以及统计肝脏和肠组织的转移瘤数量,研究COL5A2在裸鼠体内对卵巢癌的作用。通过CCK8实验、Ed U实验检测COL5A2对卵巢癌增殖能力的影响,通过细胞划痕实验、Transwell实验检测COL5A2对卵巢癌迁移和侵袭能力的影响,研究COL5A2在体外对卵巢癌的作用。（2）通过生物信息学分析筛选出COL5A2可能的受体。用小干扰RNA沉默受体或用阻断抗体阻断受体结合位点,再加入外源性的COL5A2,通过CCK8实验、Ed U实验检测沉默或阻断受体后COL5A2对卵巢癌增殖能力的影响。通过细胞划痕实验、Transwell实验检测沉默或阻断受体后COL5A2对卵巢癌迁移和侵袭能力的影响。再通过细胞免疫荧光实验检测COL5A2和受体的共定位。（3）明确COL5A2作用的下游信号通路。将COL5A2与卵巢癌细胞共孵育,通过Western blot检测加入COL5A2后卵巢癌细胞中的p-FAK、p-PI3K、pAKT的表达量。然后,沉默或阻断受体后加入COL5A2,通过Western blot检测卵巢癌细胞中的p-FAK、p-PI3K、p-AKT的表达量。最后加入FAK/PI3K/AKT信号通路抑制剂,通过Western blot、CCK8实验、Ed U实验、细胞划痕实验、Transwell实验检测FAK/PI3K/AKT信号通路的激活与COL5A2对卵巢癌增殖、迁移和侵袭影响的相关性。结果1.COL5A2在卵巢肿瘤微环境中的表达变化的机制（1）相比于正常卵巢组织,COL5A2在卵巢癌组织中高表达。且数据库分析发现COL5A2高表达时,卵巢癌的预后更差。（2）数据库分析发现COL5A2主要来源于成纤维细胞。并且在卵巢癌中胶原沉积与肿瘤相关成纤维细胞密切相关。随后,成功提取了原代人源卵巢肿瘤相关成纤维细胞并通过在提取的原代人源卵巢肿瘤相关成纤维细胞和卵巢癌细胞系ES-2、SKOV3细胞中验证发现,COL5A2主要来源于肿瘤相关成纤维细胞,而不是卵巢癌细胞。（3）用外泌体抑制剂GW4869处理后的卵巢癌细胞上清刺激CAFs表达和分泌COL5A2的能力明显下降,说明在卵巢癌细胞上清中卵巢癌细胞分泌的外泌体起到关键作用。（4）卵巢癌细胞分泌的外泌体能活化CAFs的功能并促进CAFs表达和分泌COL5A2。（5）ITGB1是卵巢癌细胞外泌体携带并影响CAFs功能的主要蛋白。敲低ITGB1的卵巢癌细胞外泌体抑制了其能活化CAFs以及促进CAFs表达和分泌COL5A2的能力。说明卵巢癌细胞通过分泌携带ITGB1的外泌体活化CAFs的功能并促进CAFs表达和分泌COL5A2。2.COL5A2对卵巢癌增殖,迁移和侵袭能力影响的机制（1）COL5A2在体内和体外均能促进卵巢癌的增殖、迁移和侵袭。（2）COL5A2与卵巢癌细胞共孵育后,卵巢癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力明显增强。而沉默或阻断ITGAV后加入COL5A2,卵巢癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力又显著降低,说明COL5A2能与卵巢癌细胞表面的ITGAV结合促进卵巢癌细胞的增殖、迁移和侵袭。（3）COL5A2与卵巢癌细胞共孵育后,卵巢癌细胞中的p-FAK、p-PI3K、p-AKT的表达量明显增加。而沉默或阻断ITGAV后加入COL5A2,卵巢癌细胞中的p-FAK、p-PI3K、p-AKT的表达量又明显减少。并且FAK/PI3K/AKT信号通路抑制剂能抑制COL5A2促进卵巢癌增殖、迁移和侵袭的能力。说明COL5A2能通过与卵巢癌细胞表面的ITGAV结合激活卵巢癌细胞的FAK/PI3K/AKT信号通路进而促进卵巢癌的增殖、迁移和侵袭。结论卵巢癌细胞通过分泌携带ITGB1的外泌体活化卵巢肿瘤相关成纤维细胞并促进其表达和分泌COL5A2。而大量表达和分泌的COL5A2可以作为反馈环路中的信号分子又作用于卵巢癌细胞,与卵巢癌细胞表面的ITGAV受体结合,进而激活卵巢癌细胞的FAK/PI3K/AKT信号通路,促进卵巢癌的增殖、迁移和侵袭。在卵巢肿瘤微环境中,卵巢癌细胞和卵巢肿瘤相关成纤维细胞存在正反馈机制,两者之间的相互作用促使卵巢癌进展。创新点及研究意义本研究发现了在卵巢肿瘤微环境中肿瘤细胞和肿瘤相关成纤维细胞相互作用的新机制。明确肿瘤相关成纤维细胞在肿瘤微环境中的作用,为靶向肿瘤相关成纤维细胞治疗卵巢癌提供了理论基础,同时为卵巢癌的治疗提供了新思路。此外,COL5A2是在卵巢癌细胞和卵巢肿瘤相关成纤维细胞相互作用的过程中的关键分子,提示COL5A2可能成为卵巢癌治疗的新靶点。