旋毛虫（Trichinella spiralis,T.spiralis）是一种能感染多种宿主的线虫,是重要的人兽共患病病原之一。旋毛虫病在世界范围内流行,造成了巨大的公共卫生安全隐患。研究不同阶段旋毛虫差异性表达的蛋白有助于进一步了解旋毛虫的发育过程和入侵感染的机制。二肽基肽酶1（dipeptidyl peptidase 1,Dpp1）是属于木瓜蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶家族的蛋白,也称为半胱氨酸组织蛋白酶C。旋毛虫Dpp1蛋白为差异表达蛋白,对其进行克隆表达,研究其对大鼠外周血单个核细胞功能和大鼠体内细胞因子分泌的影响,并评价其免疫保护力,为筛选疫苗抗原提供依据。1.旋毛虫Dpp1基因的克隆与表达采用旋毛虫肌肉幼虫总RNA作为RT-PCR模板,设计特异性引物进行PCR反应,获得旋毛虫Dpp1基因（GenBank登录号:Tsp02997）。扩增产物通过凝胶回收纯化,连接至pET-32a（+）原核表达载体上并转入DH5α大肠杆菌中。挑取单克隆提取质粒经双酶切验证,阳性质粒进行测序并进行序列分析。结果表明,Dpp1基因的ORF为1380 bp,编码459个氨基酸,理论等电点为6.73,理论相对分子量52.76 kDa,无信号肽,无跨膜区,有1个组织蛋白酶C排除域（CathepsinCexc）和1个肽酶（peptidaseC1A）的结构功能域。序列比对发现有保守的氨基酸残基,进化树分析进化距离哺乳动物较远,但3级结构为保守的Dpp1结构。将构建成功的原核表达载体pET-32a（+）/Dpp1转入大肠杆菌BL21（DE3）中,进行诱导表达。SDS-PAGE结果发现构建的重组质粒pET-32a（+）/Dpp1可在大肠杆菌BL21（DE3）中表达,且重组蛋白rDpp1（72 kDa）主要在包涵体中。经活化重组蛋白rDpp1有一定的水解活性。经免疫荧光定位蛋白主要表达在成虫虫体表皮,在肌肉幼虫广泛分布。荧光定量结果显示Dpp1基因在虫体三个阶段均表达且在肌肉幼虫中最高。Western blot结果表明重组蛋白被人工感染旋毛虫的小鼠血清所识别,表明该重组蛋白免疫原性较好。2.旋毛虫rDpp1对大鼠PBMCs功能的影响分离得到大鼠外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）,将大鼠PBMCs与rDpp1共孵育,用间接免疫荧光试验（IFA）分析rDpp1与大鼠PBMCs的结合情况,分析不同浓度的rDpp1（10、20、40 μg/mL）对细胞增殖、迁移、NO分泌、吞噬功能和细胞凋亡的影响。结果表明,40μg/mL浓度的rDpp1极显著促进PBMCs增殖;10 μg/mL的rDpp1能显著促进PBMCs迁移,而20及40μg/mL浓度时表现极显著的促进;20与40 μg/mL浓度的rDpp1极显著促进PBMCs分泌NO;10μg/mL的rDpp1能显著促进PBMCs吞噬功能,而20及40 μg/mL浓度时表现极显著的促进;各浓度蛋白都极显著的促进PBMCs的凋亡。3.rDpp1对大鼠体内细胞因子分泌的影响和抗体阻断试验为了研究rDpp 1重组蛋白对大鼠体内细胞因子分泌的影响,将50只标重SD大鼠每组10只随机分成5组。第1、2组分别腹腔注射160 μg的pET-32a空载体蛋白和等体积的PBS,第3、4、5组分别腹腔注射10、40、160 μg的rDpp1重组蛋白。于注射前（第0天）,注射后第1、2、3、4、5和6天采集血清。用ELISA检测试剂盒检测血清中IL-4、IL-9、IL-17、TGF-β和IFN-γ的含量。试验结果证明,rDpp1组大鼠体内IFN-y的分泌相比对照组显著提高,IL-17的分泌水平则显著下调。为了研究rDpp1高免血清是否可以阻断旋毛虫感染小鼠,将旋毛虫肌肉幼虫分别用PBS组、阴性血清以及抗rDpp血清孵育2h,将孵育后洗净的肌肉幼虫感染小鼠,每只小鼠攻虫500条,每组10只Balb/c小鼠。感染7天后收集并统计成虫数量。结果显示抗rDpp1血清组成虫数量显著低于PBS组（P＜0.05）,成虫减虫率为39.27%。将旋毛虫新生幼虫同样孵育2h,尾静脉注射感染小鼠,每只小鼠攻虫6000条,每组4只Balb/c小鼠。计感染30天后肌肉幼虫数量,结果显示抗rDpp1血清组减虫效果不显著（P＞0.05）。4.rDpp1的免疫保护性研究为了研究rDpp1重组蛋白的免疫保护作用,将60只Balb/c小鼠分3组,每组20只。第1组为PBS免疫对照组,第2组为pET-32a空载体蛋白免疫对照组,第3组为rDpp1免疫组。用免疫佐剂乳化的40 μg空载体蛋白、重组蛋白及等体积的乳化PBS进行两次免疫后,在第28天通过灌胃法感染肌肉幼虫400条,检测免疫前（第0天）、首免后一周（第7天）、二免（第14天）、二免后一周（第21天）以及二免后两周（第28天）小鼠血清中特异性IgG、IgG1和IgG2a抗体水平的变化。计算在感染后第7天成虫数量的变化,以及感染后第35天肌肉幼虫数量的变化。结果与对照组相比,rDpp 1能够引起特异性IgG抗体显著升高,IgG 1亚型和IgG2a亚型的变化与IgG相似,只是免疫后IgG1亚型升高的水平更高。rDpp1免疫组的旋毛虫成虫与肌肉幼虫数量较对照组显著减少,成虫减虫率为47.7%,肌肉幼虫减虫率为64.54%。