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布鲁氏菌病(Brucellosis)是由布鲁氏菌引起的一种细菌性人畜共患的慢性传染病，严重影响了畜牧业健康可持续发展；人类也可通过接触受感染动物的分泌物，或进食受污染的畜产品而受感染，严重威胁人类健康和社会公共卫生安全。布鲁氏菌作为布鲁氏菌病的病原菌，对胚胎滋养层细胞具有一定的亲嗜性，易引起流产，但是其分子致病机制目前还不清楚。布鲁氏菌强弱毒株在自身生长繁殖以及对宿主细胞的侵染、胞内生存等方面存在一定差异，因此，以布鲁氏菌强弱毒株的差异蛋白和胚胎滋养层细胞为研究对象对于布鲁氏菌致病机制的研究具有重要意义。目的：本研究以牛种布鲁氏菌2308强毒株和RB51疫苗株的差异蛋白（DsbG、CcrB、RirA、VceA）为研究对象，构建相应的基因突变株，比较相应的基因突变株和亲本株在自身生长状况，以及侵染滋养层细胞后，对宿主细胞的黏附、胞内生存及凋亡等方面产生的影响，初步探索这些差异蛋白的功能。为揭示布鲁氏菌分子致病机制和布鲁氏菌新型药物的开发奠定基础。方法：（1）以热灭活的牛种布鲁氏菌2308基因组和带有卡那抗性基因的pUC19K质粒为模板，分别对dsbG、ccrB、rirA、vceA基因的上下游同源臂和卡那抗性（Kan）基因进行高保真扩增；通过融合PCR技术将待缺失基因的上下游同源臂与卡那抗性基因融合，将融合片段直接连接到pMD19-T克隆载体上；采用电转化法将同源重组载体转入布鲁氏菌2308感受态细胞中，对S2308ΔdsbG、ΔccrB、ΔrirA和ΔvceA基因突变株进行筛选和遗传稳定性检测；绘制布鲁氏菌生长曲线并观察静置培养后细菌的聚集现象。（2）布鲁氏菌亲本株及S2308ΔdsbG、ΔccrB、ΔrirA和ΔvceA基因突变株侵染胚胎滋养层细胞，对侵染后的细胞进行形态学观察，并对其粘附侵袭力和胞内复制力进行评价，分析布鲁氏菌突变株胞内生存的能力；（3）通过Hoechst荧光染色和DNAladder分析凋亡细胞的细胞核变化及其DNA的片段化，同时通过流式细胞仪对细胞凋亡率进行检测。结果：（1）构建并筛选出布鲁氏菌S2308ΔdsbG、ΔccrB、ΔrirA和ΔvceA基因突变株，且连续10代内未发生回复突变现象。相应的基因突变株体外培养的生长趋势与亲本株2308类似，培养32h细菌进入对数生长期，40h左右进入平台期，但不同时间点细菌的浓度存在差异，布鲁氏菌ΔrirA和ΔvceA基因突变株较亲本株提前4h进入平台期；静置培养的布鲁氏菌基因突变株均呈浑浊生长状态，与亲本株2308相比未发生明显改变；（2）布鲁氏菌S2308ΔdsbG、ΔccrB、ΔrirA和ΔvceA突变株侵染胚胎滋养层细胞（HPT-8）后，细胞出现变圆、皱缩，细胞间隔变宽，易出现聚合现象；布鲁氏菌粘附侵染细胞的结果显示，随着时间的延长，细菌进入细胞的数量增多，大约90min达到饱和状态，其中相同时间内ΔrirA突变株进入细胞的数量多于亲本株。而S2308ΔdsbG在粘附滋养层细胞达到饱和状态前胞内菌量较2308亲本株少；ΔccrB和ΔvceA突变株进入胞内的数量虽然较亲本株2308略有增多,但侵染滋养层细胞90min后胞内菌量基本接近于亲本株。布鲁氏菌胞内存活的实验结果显示，侵染4h后，布鲁氏菌RB51、ΔccrB和ΔvceA突变株胞内菌量持续下降。S2308ΔdsbG基因突变株虽然其胞内菌量低于亲本株，但总体趋势一致，ΔrirA基因突变株胞内菌量基本维持在一定量水平。（3）布鲁氏菌以200:1比例侵染细胞后通过流式细胞仪检测不同时间点的细胞凋亡，发现随着侵染时间的延长布鲁氏菌引起的细胞凋亡率增加，ΔccrB和ΔdsbG基因突变株与亲本株2308相比凋亡率无明显区别，而ΔrirA和ΔvceA突变株与亲本株2308相比细胞凋亡率呈现增大趋势。各布鲁氏菌菌株以500:1侵染细胞后，Hoechst荧光染色结果显示，随着侵染时间的延长，细胞核皱缩边集的现象越来越严重，ΔccrB和ΔdsbG基因突变株与亲本株2308相比细胞核边集数量无明显变化，而ΔrirA和ΔvceA突变株引起细胞核边集的数量高于亲本株2308。使用细胞凋亡DNAladder提取试剂盒对凋亡细胞的DNA片段进行分析发现，侵染6天后的DNA电泳条带呈现梯度条带。结论：成功构建并获得稳定遗传的布鲁氏菌S2308ΔdsbG、ΔccrB、ΔrirA和ΔvceA基因突变株,其自身生长趋势与亲本株类似，其中ΔrirA和ΔvceA基因突变株的生长速度快于亲本株；并且这些基因突变株和亲本株2308均不能引起自身的聚集现象；dsbG、ccrB、rirA和vceA基因缺失后布鲁氏菌胞内生存相关表型发生了变化，ΔrirA突变株粘附侵染能力高于亲本株，ΔdsbG基因突变株粘附细胞的能力较亲本株低，而ΔccrB和ΔvceA基因突变株在滋养层细胞的中复制能力低于亲本株。对细胞凋亡的研究发现，ΔrirA和ΔvceA突变株较亲本株可促进细胞的凋亡。本研究为揭示布鲁氏菌引发流产的分子机制提供了线索，也为布鲁氏菌病新药物研发、防治奠定了基础。