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本论文拟通过小鼠视网膜光损伤的病理研究、P2x4和TRPV1受体在BBR抗视网膜光损伤作用研究,探索BBR抗视网膜光损伤作用机制。一:小鼠视网膜光损伤的病理研究研究目的:在前期研究发现小檗碱具有抗小鼠视网膜光损伤的基础上,运用前期实验模型,分析小鼠视网膜光损伤后的病理变化,以为后续实验奠定基础。研究方法:选用健康清洁级C57BL/6J小鼠,随机分为空白组和LD组两组,每组各3只。LD组小鼠在自制光损伤箱中给予10000±1500Lux、4小时的光照。造模48h后,摘取右眼于4%多聚甲醛固定液中固定,摘取左眼并提取视网膜。HE染色测量视网膜ONL层厚度,观察光损伤对视网膜形态的影响。Tunel-POD检测法观察两组视网膜ONL层细胞凋亡的情况。研究结果:1.HE染色观察视网膜形态,结果显示:空白组视网膜形态正常,各层结构层次分明:神经节细胞核排列整齐;内核层、外核层细胞核排列紧密,染色均匀,细胞核形态完整;光感受器细胞内外节排列规则,分界清晰。LD组视网膜部分神经节细胞核缩小,染色加深,疏松样排列;内核层细胞核排列紧密、整齐;外核层细胞核排列紊乱,部分细胞核浓缩、聚集、染色加深;光感受器细胞内、外节排列稍紊乱,视杆外节排列紊乱,膜盘间隙部分断裂。LD组视网膜ONL层变薄。2.TUNEL观察小鼠视网膜ONL层细胞凋亡情况:空白组小鼠视网膜组织未见细胞凋亡,光照48h后LD组小鼠视网膜组织中出现大量的细胞凋亡,其差异具有统计学意义(P<0.05)。第二部分P2x4受体在BBR抗视网膜光损伤的作用机制研究研究目的:在前期实验基础上,进一步从嘌呤信号P2x4受体角揭示小檗碱抗视网膜光损伤的作用机制,为临床小檗碱治疗老年性黄斑变性等视网膜光损伤疾病提供科学依据。研究方法:选用健康清洁级C57BL/6J小鼠,随机分为三组,分别为空白组、LD组和BBR组,每组各6只。BBR组小鼠给予200mg/Kg浓度的BBR溶液灌胃,空白组及LD组每天给予PBS灌胃。7天后,LD组和BBR组均给予10000± 1500Lux、4小时的光照。光照后继续灌胃,并在光照48h后,摘取右眼于4%多聚甲醛固定液中固定切片,摘取左眼并取视网膜以提取RNA。采用Q-PCR技术检测小鼠视网膜中P2x4的表达情况。并采用免疫荧光双标法观察检测小鼠视网膜ONL层中小胶质细胞与P2x4阳性表达情况。研究结果:1.Q-PCR实验结果显示:与空白组比较,LD组视网膜P2rx4mRNA表达下调,差异有统计学意义(P<0.05);与LD组比较,BBR组视网膜的P2rx4 mRNA表达上调,其差异有统计学意义(P<0.05)。2.免疫荧光双标观察视网膜ONL层小胶质细胞数量及P2x4阳性表达情况显示:结果观察到小胶质细胞和P2x4标记物在视网膜中存在共定位,但数量较少,每个视野仅数个。与空白组比较,LD组ONL层小胶质细胞增多,其差异有统计学意义(P<0.05);与LD组比较,BBR组ONL层小胶质细胞降低,其差异有统计学意义(P<0.05)。与空白组比较,LD组视网膜ONL层P2x4的表达增高,其差异有统计学意义(P<0.05);与LD组比较,BBR组视网膜ONL层P2x4的表达降低,其差异有统计学意义(P<0.05)。第三部分TRPV1受体在BBR抗视网膜光损伤作用的研究研究目的:从TRPV1受体角度探索小檗碱抗视网膜光损伤的作用,为临床小檗碱治疗老年性黄斑变性等视网膜光损伤疾病提供科学依据。研究方法:选用同种系野生小鼠C57BL/6小鼠及TRPV1基因敲除(TRPV1 KO)小鼠,随机分为三组,分别为空白组、LD组和BBR组,每种系小鼠每组各6只。BBR组小鼠给予200mg/Kg浓度的BBR溶液灌胃,空白组及LD组每天给予PBS灌胃。7天后,LD组和BBR组均给予10000± 1500Lux、4小时的光照。光照后继续灌胃,并在光照48h后,摘取右眼于4%多聚甲醛固定液中固定,摘取左眼并提取视网膜。分别用HE、TUNEL观察视网膜ONL层厚度及细胞凋亡情况。采用Q-PCR技术检测野生小鼠C57BL/6小鼠视网膜中TRPV1的表达情况。研究结果:1.HE染色法分别观察三组小鼠视网膜形态,结果显示:空白组视网膜形态正常,各层结构层次分明;神经节细胞核排列整齐;内核层、外核层细胞核排列紧密,染色均匀,细胞核形态完整;光感受器细胞内外节排列规则,分界清晰。LD组部分神经节细胞核缩小,染色加深,疏松样排列;内核层细胞核排列紧密、整齐;外核层细胞核排列紊乱,部分细胞核浓缩、聚集、染色加深;光感受器细胞内、外节排列稍紊乱,视杆外节排列紊乱,膜盘间隙部分断裂。BBR组视网膜形态略有异常,结构层次分明:神经节细胞核排列稍稀疏;内核层、外核层细胞核排列紧密,染色均匀,细胞核形态完整;光感受器细胞内外节排列稍紊乱。LD组小鼠光照48h后,外核层厚度变薄;BBR灌胃组小鼠视网膜外核层厚度比LD组厚。TRPV1WT小鼠模型组和正常相比,厚度降低17.11%;BBR治疗后,和模型组相比,外核层厚度增加17.37%。TRPV1KO小鼠模型组和正常相比,厚度降低20.51%;BBR治疗后,和模型组相比,外核层厚度增加28.90%。基因敲除小鼠ONL层厚度比野生型小鼠薄,无统计学差异(P>0.05),基因敲除对ONL层厚度变化无明显影响。2.TUNEL观察小鼠视网膜ONL层细胞凋亡情况显示:空白组小鼠视网膜组织未见细胞凋亡;光照48h后LD组小鼠视网膜组织中出现TUNEL阳性细胞表达,呈棕黄色染色,阳性细胞核皱缩;BBR组小鼠视网膜组织见少量细胞凋亡。与空白组比较,LD组ONL层中凋亡细胞数明显增多,二者有统计学差异(P<0.05);BBR组ONL层凋亡细胞数量略有增高,但无统计学差异(P>0.05);与LD比较,BBR组ONL层中凋亡细胞数量降低,有统计学差异(P<0.05)。ONL层细胞凋亡率对比,基因敲除小鼠比野生型小鼠高,无统计学差异(P>0.05);但是,BBR组中基因敲除小鼠细胞凋亡率比野生型高,具有统计学差异(P<0.05)。基因敲除对ONL层细胞凋亡有影响。3.Q-PCR实验结果显示:与空白组比较,LD组视网膜TRPV1mRNA表达下调,其差异具有统计学意义(P<0.05);LD组视网膜TRPV1mRNA表达下调,但差异无统计学意义(P>0.05)。与模型组比较,灌胃组小鼠的TRPV1mRNA表达上调,具有统计学差异(P<0.05)。研究结论:1.BBR具有较好的抗视网膜光损伤的作用。2.P2x4受体,可能会通过调控小胶质细胞,参与BBR抗视网膜光损伤的作用。3.TRPV1受体具有一定的视网膜保护作用,是视网膜光损伤的重要病理机制,并可能参与了 BBR抗视网膜光损伤作用。