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第一部分：HSV-2黏附及穿入VK2/E6E7细胞的特征研究
目的：为研究洁泽1号体外抗HSV-2感染VK2/E6E7细胞的作用阶段及其作用机制，在已建立的稳定的生殖器疱疹体外模型的基础上，根据常温及温控技术下HSV-2感染VK2/E6E7时间与宿主细胞的变化特征，探索建立HSV-2黏附及穿入VK2/E6E7细胞的体外模型。
方法：通过将HSV-2在Vero细胞中扩增的方法得到毒力稳定且达造模标准的病毒液，使HSV-2感染VK2/E6E7细胞24小时后细胞存活率为正常对照组的40%~60%。测定室温及温控技术下HSV-2穿入VK2/E6E7细胞的确切时间，探索温控技术下HSV-2黏附及穿入VK2/E6E7对细胞存活率、病毒囊膜gD蛋白表达位置、病毒蛋白gD、gB、VP16、ICP5和ICP4表达量、细胞膜受体蛋白Nectin-1、Nectin-2和HVEM表达量及宿主细胞超微病理学表现的影响，为采用温控技术建立HSV-2黏附及穿入VK2/E6E7细胞的体外模型提供时间依据。
结果：HSV-2在室温下与VK2/E6E7接触5min便可完全黏附并穿入宿主细胞，而在温控技术下需60min，这一特征为探索洁泽1号抗病毒阶段及药效提供了可能性；温控技术下病毒黏附组及病毒穿入组细胞存活率仅为正常对照组50%左右，证明有足够量病毒颗粒感染宿主细胞并使宿主细胞存活率达到造模标准；温控技术下病毒黏附组病毒囊膜gD蛋白集中表达于宿主细胞膜表面，病毒结构蛋白gD、VP16、ICP5表达量显著升高，而病毒复制期蛋白ICP4无表达，且扫描电镜下可观察到细胞膜表面附着的大量病毒颗粒，确立此方法确可使病毒颗粒黏附而不穿入于细胞膜；温控技术下病毒穿入组病毒囊膜gD蛋白集中表达于宿主细胞质内，病毒结构蛋白gD、VP16、ICP5表达量显著升高，而病毒复制期蛋白ICP4无表达，确立此方法确可使病毒颗粒穿入于细胞膜而未入核。以上研究结果为探索洁泽1号抗病毒阶段及药效提供了条件。
结论：采用温控技术可建立稳定的HSV-2黏附及穿入VK2/E6E7细胞体外模型，为后续研究洁泽1号抗HSV-2黏附及穿入VK2/E6E7细胞作用机制研究奠定了基础。
第二部分：中药复方洁泽1号干预HSV-2黏附与穿入VK2/E6E7细胞作用及机制研究
目的：基于稳定的HSV-2黏附及穿入VK2/E6E7细胞模型，研究中药复方洁泽1号抗生殖器疱疹病毒黏附与穿入阴道上皮细胞的作用及其机制。
方法：建立稳定的HSV-2感染VK2/E6E7细胞的体外模型并通过常温下药物作用6小时、12小时、18小时及24小时后观察细胞形态学及超微结构变化、检测细胞存活率及病毒囊膜gD蛋白的荧光表达，明确洁泽1号体外抗HSV-2药效；分别在HSV-2黏附及穿入阶段给予洁泽1号等药物干预，通过对比各组细胞存活率、病毒囊膜gD蛋白的荧光表达、扫描电镜下细胞超微结构的变化、病毒蛋白gB、gD、VP16、ICP5、ICP4及细胞受体蛋白HVEM、Nectin-1、Nectin-2的表达研究洁泽1号干预HSV-2黏附与穿入宿主细胞的作用与机制。
结果：药物、HSV-2与VK2/E6E7共敷浴24小时条件下洁泽1号与喷昔洛韦均表现出抗病毒、改善细胞形态和提高细胞存活率的作用，且洁泽1号抗病毒作用优于化学药物喷昔洛韦，洁泽1号君药的主要成分小檗碱并未表现出体外抗病毒的作用。洁泽1号抗HSV-2作用在用药6h便可检测到，而喷昔洛韦抗HSV-2作用在共敷浴12h后才发挥。洁泽1号在HSV-2黏附及穿入VK2/E6E7细胞阶段均表现出良好的干预作用，通过下调病毒蛋白gB、gD、VP16、ICP5、ICP4的表达，洁泽1号可明显减少黏附及穿入细胞的病毒量，并改善细胞形态、提高细胞存活率，但此作用并非通过下调膜融合相关蛋白HVEM、Nectin-1及Nectin-2的表达而发挥，其具体机制尚需深入探索；喷昔洛韦及小檗碱均无明显抗HSV-2黏附及穿入VK2/E6E7细胞的作用。
结论：洁泽1号体外有确切的抗HSV-2药效，其抗病毒疗效明显优于喷昔洛韦及组成成分小檗碱，可通过干预HSV-2黏附及穿入宿主细胞发挥作用。
第三部分：目的：为进一步在体内验证洁泽1号抗HSV-2作用并探索其相关机制，需构建稳定的生殖器疱疹小鼠模型。在课题组前期研究的基础上，细化小鼠周龄、体重、造模操作方法、接种病毒量、接种病毒毒力、症状评分标准等参数，进一步优化生殖器疱疹体内模型。并通过检测生殖器疱疹模型小鼠不同时间点目的指标变化趋势为后续实验提供时间依据。
方法：控制小鼠来源、品系、饲养条件的基础上，明确实验小鼠周龄、体重，统一造模操作方法，改良生殖器疱疹小鼠模型症状评分标准及模型成功评价标准，联合TCID50及PFU法测定造模病毒滴度，并对比不同病毒毒力下小鼠造模成功率及死亡率，选择合适的造模病毒使小鼠成模率介于80%-100%，小鼠死亡率介于0%-20%之间。检测生殖器疱疹模型小鼠造模后第12小时、第1、3、5、7、9、12、14天体重变化、外阴症状评分变化、小鼠阴道病变程度、阴道组织T细胞、NK细胞及DC细胞浸润程度、组织膜融合相关蛋白(gD、VP16、ICP5及nectin-1、nectin-2、HVEM)表达的变化，为后续用药时间点的选择提供依据。
结果：控制小鼠来源、饲养条件、操作手法等实验条件下，适应性喂养体重20±2gSPF级纯系BALB/C雌鼠一周后，连续5天肌注黄体酮注射液，第6天戊巴比妥钠腹腔麻醉后锐器反复摩擦小鼠阴道50次，注射20μl毒力在1×106TCID50/0.1ML~1×108TCID50/0.1ML之间，或2×104PFU/ML~2×106PFU/ML之间的HSV-2病毒液，可使小鼠症状高峰期外阴症状评分介于1.5-4分，感染后5-8天体重下降大于1g，且小鼠成模率介于80%-100%，小鼠死亡率介于0%-20%之间，从而建立稳定的生殖器疱疹小鼠模型。造模后12小时，阴道组织病毒蛋白gD、VP16、ICP5与细胞膜融合受体蛋白HVEM、Nectin-1、Nectin-2的表达量迅速升高达到高峰，炎症细胞浸润量增多，故选择造模后12h为探索体内实验中洁泽1号对生殖器疱疹小鼠早期阶段作用的时间点。造模后第9天，生殖器疱疹模型小鼠达症状高峰期，小鼠体重降至最低点，外阴症状评分上升为最高点，阴道粘膜病理表现达到高峰，阴道组织炎症细胞浸润量达到高峰，故选择第9天为探索体内实验中洁泽1号对生殖器疱疹小鼠症状高峰期干预作用的时间点。
结论：控制小鼠来源、品系、周龄、体重、饲养条件、病毒毒力、病毒接种量等条件，统一造模操作方法，改良小鼠模型症状评分标准及模型成功评价标准，可建立稳定的生殖器疱疹小鼠模型，并为研究洁泽1号体内抗生殖器疱疹的作用机制奠定基础。
第四部分：中药复方洁泽1号对生殖器疱疹小鼠干预作用及机制研究
目的：建立稳定的生殖器疱疹小鼠模型，基于膜融合探索中药复方洁泽1号对生殖器疱疹小鼠感染早期及症状高峰期干预作用及其作用机制，以期为开发新型抗单纯疱疹病毒药物提供理论依据。
方法：在控制药材质量及凝胶制剂工艺的前提下，制备性质稳定的洁泽1号凝胶。对比不同浓度洁泽1号凝胶对生殖器疱疹小鼠外阴症状及体重的影响，探索整体动物实验中洁泽1号抗HSV-2的有效浓度。选择洁泽1号凝胶最适浓度梯度，对比感染早期及症状高峰期各组小鼠体重、外阴症状、脾脏指数、脊神经节病毒载量、阴道及外阴组织病变程度、阴道分泌物病毒脱落病毒量、阴道及外阴组织T细胞、NK细胞及DC细胞浸润程度、阴道及外阴组织病毒蛋白gD、VP16、ICP5与细胞膜融合受体蛋白HVEM、Nectin-1、Nectin-2的表达量、阴道及外阴组织超微病理表现，探索洁泽1号抗HSV-2感染小鼠的作用及其机制。
结果：2.5g/ml、2g/ml、1.5g/ml、1g/ml及0.5g/ml洁泽1号均可缓解生殖器疱疹小鼠体重下降，而2.5g/ml、2g/ml、1.5g/ml、1g/ml洁泽1号均可减轻生殖器疱疹小鼠外阴症状。故选取2.5g/ml、1.5g/ml及0.5g/ml三个浓度梯度用于后续实验探索洁泽1号体内抗生殖器疱疹的作用及机制。在生殖器疱疹小鼠的治疗中，洁泽1号可通过下调病毒蛋白gD、VP16、ICP5与细胞膜受体蛋白HVEM、Nectin-2的表达量，抑制病毒黏附穿入宿主细胞而减少小鼠阴道及外阴组织病毒感染量，亦可保护细胞器而维持细胞正常形态与功能，减少组织T细胞、NK细胞及DC细胞浸润量，缓解局部及全身炎症反应，并促进组织角化修复，从而起到减轻生殖器疱疹小鼠外阴症状并减少其体重下降的作用。通过下调脊神经节病毒载量，洁泽1号可一定程度控制疾病复发。通过减少阴道病毒脱落量，洁泽1号亦可用于预防交叉感染。其中以2.5g/ml洁泽1号疗效最佳。洁泽1号体内抗HSV-2药效与临床常用药物阿昔洛韦相当，而小檗碱无此作用。
结论：洁泽1号体内有明确的抗HSV-2药效，可通过干预生殖器疱疹小鼠感染早期及症状高峰期病毒膜融合发挥作用，亦可控制疾病复发，并预防交叉感染。复方抗病毒疗效与阿昔洛韦相当，而组成成分小檗碱无此作用。
目的：为研究洁泽1号体外抗HSV-2感染VK2/E6E7细胞的作用阶段及其作用机制，在已建立的稳定的生殖器疱疹体外模型的基础上，根据常温及温控技术下HSV-2感染VK2/E6E7时间与宿主细胞的变化特征，探索建立HSV-2黏附及穿入VK2/E6E7细胞的体外模型。
方法：通过将HSV-2在Vero细胞中扩增的方法得到毒力稳定且达造模标准的病毒液，使HSV-2感染VK2/E6E7细胞24小时后细胞存活率为正常对照组的40%~60%。测定室温及温控技术下HSV-2穿入VK2/E6E7细胞的确切时间，探索温控技术下HSV-2黏附及穿入VK2/E6E7对细胞存活率、病毒囊膜gD蛋白表达位置、病毒蛋白gD、gB、VP16、ICP5和ICP4表达量、细胞膜受体蛋白Nectin-1、Nectin-2和HVEM表达量及宿主细胞超微病理学表现的影响，为采用温控技术建立HSV-2黏附及穿入VK2/E6E7细胞的体外模型提供时间依据。
结果：HSV-2在室温下与VK2/E6E7接触5min便可完全黏附并穿入宿主细胞，而在温控技术下需60min，这一特征为探索洁泽1号抗病毒阶段及药效提供了可能性；温控技术下病毒黏附组及病毒穿入组细胞存活率仅为正常对照组50%左右，证明有足够量病毒颗粒感染宿主细胞并使宿主细胞存活率达到造模标准；温控技术下病毒黏附组病毒囊膜gD蛋白集中表达于宿主细胞膜表面，病毒结构蛋白gD、VP16、ICP5表达量显著升高，而病毒复制期蛋白ICP4无表达，且扫描电镜下可观察到细胞膜表面附着的大量病毒颗粒，确立此方法确可使病毒颗粒黏附而不穿入于细胞膜；温控技术下病毒穿入组病毒囊膜gD蛋白集中表达于宿主细胞质内，病毒结构蛋白gD、VP16、ICP5表达量显著升高，而病毒复制期蛋白ICP4无表达，确立此方法确可使病毒颗粒穿入于细胞膜而未入核。以上研究结果为探索洁泽1号抗病毒阶段及药效提供了条件。
结论：采用温控技术可建立稳定的HSV-2黏附及穿入VK2/E6E7细胞体外模型，为后续研究洁泽1号抗HSV-2黏附及穿入VK2/E6E7细胞作用机制研究奠定了基础。
第二部分：中药复方洁泽1号干预HSV-2黏附与穿入VK2/E6E7细胞作用及机制研究
目的：基于稳定的HSV-2黏附及穿入VK2/E6E7细胞模型，研究中药复方洁泽1号抗生殖器疱疹病毒黏附与穿入阴道上皮细胞的作用及其机制。
方法：建立稳定的HSV-2感染VK2/E6E7细胞的体外模型并通过常温下药物作用6小时、12小时、18小时及24小时后观察细胞形态学及超微结构变化、检测细胞存活率及病毒囊膜gD蛋白的荧光表达，明确洁泽1号体外抗HSV-2药效；分别在HSV-2黏附及穿入阶段给予洁泽1号等药物干预，通过对比各组细胞存活率、病毒囊膜gD蛋白的荧光表达、扫描电镜下细胞超微结构的变化、病毒蛋白gB、gD、VP16、ICP5、ICP4及细胞受体蛋白HVEM、Nectin-1、Nectin-2的表达研究洁泽1号干预HSV-2黏附与穿入宿主细胞的作用与机制。
结果：药物、HSV-2与VK2/E6E7共敷浴24小时条件下洁泽1号与喷昔洛韦均表现出抗病毒、改善细胞形态和提高细胞存活率的作用，且洁泽1号抗病毒作用优于化学药物喷昔洛韦，洁泽1号君药的主要成分小檗碱并未表现出体外抗病毒的作用。洁泽1号抗HSV-2作用在用药6h便可检测到，而喷昔洛韦抗HSV-2作用在共敷浴12h后才发挥。洁泽1号在HSV-2黏附及穿入VK2/E6E7细胞阶段均表现出良好的干预作用，通过下调病毒蛋白gB、gD、VP16、ICP5、ICP4的表达，洁泽1号可明显减少黏附及穿入细胞的病毒量，并改善细胞形态、提高细胞存活率，但此作用并非通过下调膜融合相关蛋白HVEM、Nectin-1及Nectin-2的表达而发挥，其具体机制尚需深入探索；喷昔洛韦及小檗碱均无明显抗HSV-2黏附及穿入VK2/E6E7细胞的作用。
结论：洁泽1号体外有确切的抗HSV-2药效，其抗病毒疗效明显优于喷昔洛韦及组成成分小檗碱，可通过干预HSV-2黏附及穿入宿主细胞发挥作用。
第三部分：目的：为进一步在体内验证洁泽1号抗HSV-2作用并探索其相关机制，需构建稳定的生殖器疱疹小鼠模型。在课题组前期研究的基础上，细化小鼠周龄、体重、造模操作方法、接种病毒量、接种病毒毒力、症状评分标准等参数，进一步优化生殖器疱疹体内模型。并通过检测生殖器疱疹模型小鼠不同时间点目的指标变化趋势为后续实验提供时间依据。
方法：控制小鼠来源、品系、饲养条件的基础上，明确实验小鼠周龄、体重，统一造模操作方法，改良生殖器疱疹小鼠模型症状评分标准及模型成功评价标准，联合TCID50及PFU法测定造模病毒滴度，并对比不同病毒毒力下小鼠造模成功率及死亡率，选择合适的造模病毒使小鼠成模率介于80%-100%，小鼠死亡率介于0%-20%之间。检测生殖器疱疹模型小鼠造模后第12小时、第1、3、5、7、9、12、14天体重变化、外阴症状评分变化、小鼠阴道病变程度、阴道组织T细胞、NK细胞及DC细胞浸润程度、组织膜融合相关蛋白(gD、VP16、ICP5及nectin-1、nectin-2、HVEM)表达的变化，为后续用药时间点的选择提供依据。
结果：控制小鼠来源、饲养条件、操作手法等实验条件下，适应性喂养体重20±2gSPF级纯系BALB/C雌鼠一周后，连续5天肌注黄体酮注射液，第6天戊巴比妥钠腹腔麻醉后锐器反复摩擦小鼠阴道50次，注射20μl毒力在1×106TCID50/0.1ML~1×108TCID50/0.1ML之间，或2×104PFU/ML~2×106PFU/ML之间的HSV-2病毒液，可使小鼠症状高峰期外阴症状评分介于1.5-4分，感染后5-8天体重下降大于1g，且小鼠成模率介于80%-100%，小鼠死亡率介于0%-20%之间，从而建立稳定的生殖器疱疹小鼠模型。造模后12小时，阴道组织病毒蛋白gD、VP16、ICP5与细胞膜融合受体蛋白HVEM、Nectin-1、Nectin-2的表达量迅速升高达到高峰，炎症细胞浸润量增多，故选择造模后12h为探索体内实验中洁泽1号对生殖器疱疹小鼠早期阶段作用的时间点。造模后第9天，生殖器疱疹模型小鼠达症状高峰期，小鼠体重降至最低点，外阴症状评分上升为最高点，阴道粘膜病理表现达到高峰，阴道组织炎症细胞浸润量达到高峰，故选择第9天为探索体内实验中洁泽1号对生殖器疱疹小鼠症状高峰期干预作用的时间点。
结论：控制小鼠来源、品系、周龄、体重、饲养条件、病毒毒力、病毒接种量等条件，统一造模操作方法，改良小鼠模型症状评分标准及模型成功评价标准，可建立稳定的生殖器疱疹小鼠模型，并为研究洁泽1号体内抗生殖器疱疹的作用机制奠定基础。
第四部分：中药复方洁泽1号对生殖器疱疹小鼠干预作用及机制研究
目的：建立稳定的生殖器疱疹小鼠模型，基于膜融合探索中药复方洁泽1号对生殖器疱疹小鼠感染早期及症状高峰期干预作用及其作用机制，以期为开发新型抗单纯疱疹病毒药物提供理论依据。
方法：在控制药材质量及凝胶制剂工艺的前提下，制备性质稳定的洁泽1号凝胶。对比不同浓度洁泽1号凝胶对生殖器疱疹小鼠外阴症状及体重的影响，探索整体动物实验中洁泽1号抗HSV-2的有效浓度。选择洁泽1号凝胶最适浓度梯度，对比感染早期及症状高峰期各组小鼠体重、外阴症状、脾脏指数、脊神经节病毒载量、阴道及外阴组织病变程度、阴道分泌物病毒脱落病毒量、阴道及外阴组织T细胞、NK细胞及DC细胞浸润程度、阴道及外阴组织病毒蛋白gD、VP16、ICP5与细胞膜融合受体蛋白HVEM、Nectin-1、Nectin-2的表达量、阴道及外阴组织超微病理表现，探索洁泽1号抗HSV-2感染小鼠的作用及其机制。
结果：2.5g/ml、2g/ml、1.5g/ml、1g/ml及0.5g/ml洁泽1号均可缓解生殖器疱疹小鼠体重下降，而2.5g/ml、2g/ml、1.5g/ml、1g/ml洁泽1号均可减轻生殖器疱疹小鼠外阴症状。故选取2.5g/ml、1.5g/ml及0.5g/ml三个浓度梯度用于后续实验探索洁泽1号体内抗生殖器疱疹的作用及机制。在生殖器疱疹小鼠的治疗中，洁泽1号可通过下调病毒蛋白gD、VP16、ICP5与细胞膜受体蛋白HVEM、Nectin-2的表达量，抑制病毒黏附穿入宿主细胞而减少小鼠阴道及外阴组织病毒感染量，亦可保护细胞器而维持细胞正常形态与功能，减少组织T细胞、NK细胞及DC细胞浸润量，缓解局部及全身炎症反应，并促进组织角化修复，从而起到减轻生殖器疱疹小鼠外阴症状并减少其体重下降的作用。通过下调脊神经节病毒载量，洁泽1号可一定程度控制疾病复发。通过减少阴道病毒脱落量，洁泽1号亦可用于预防交叉感染。其中以2.5g/ml洁泽1号疗效最佳。洁泽1号体内抗HSV-2药效与临床常用药物阿昔洛韦相当，而小檗碱无此作用。
结论：洁泽1号体内有明确的抗HSV-2药效，可通过干预生殖器疱疹小鼠感染早期及症状高峰期病毒膜融合发挥作用，亦可控制疾病复发，并预防交叉感染。复方抗病毒疗效与阿昔洛韦相当，而组成成分小檗碱无此作用。