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西瓜果斑病和番茄溃疡病都是我国对内和对外的植物检疫性细菌病害。西瓜果斑病(Bacterial fruit blotch of watermelon)是近年来新发生的一种细菌性病害,由噬酸菌属燕麦种西瓜亚种(Acidovorax avenae subsp.citrulli)引起,主要侵染葫芦科植物,对农业生产造成很大的威胁。番茄溃疡病(Bacterial canker of tomato)是番茄生产中最具有毁灭性的病害之一,严重影响番茄的产量和品质,它由密执安棒形杆菌密执安亚种(Clavibacter michiganense subsp.michiganense)引起。对于这两种细菌病害,带菌种子是病害传播的主要侵染源,而它们已在我国局部地区发生。因此,建立一种准确、快速、灵敏的西瓜果斑病菌和番茄溃疡病菌种子带菌检测方法,对我国有效阻止危险性有害生物侵入和蔓延及防治策略的制定具有重要意义。 本研究将免疫吸附富集(ISE)和经典PCR结合以提高检测效率。利用多克隆抗体技术成功获得3种抗血清,即抗Acidovorax avenae subsp.citrulli(Ab)全菌体血清1001和1002,抗Clavibacter michiganense subsp.michiganense(cmmbi)全菌体血清1011。其中1001和1002效价均达到1:64(ODD)(凝聚反应达到1:5210);且专化性较高。1011效价达到1:32(ODD)f凝聚反应达到1:1280):但专化性不够理想。 用直接PCR技术和免疫捕捉PCR技术检测西瓜果斑病菌,结果表明,所有果斑病菌都能产生360bp左右的特异性片段,而对照Pseudomonas、Xanthomonas、Erwinia、Clavibacter、Burkholderia及Bacillus的23菌株无特异性片段产生。对两种检测方法的灵敏度比较发现:在配制的浓度梯度菌悬液检测实验中,直接PCR技术能检测到1×10~4cfu/ml左右的悬浮液,免疫捕捉PCR技术能检测到50-100cfu/ml左右悬浮液;人工接种病种的检测实验中,直接PCR技术能检测到2粒及以上带菌种子制得浸悬液,而免疫捕捉PCR技术仅1粒带菌种子即可。用免疫捕捉PCR技术对市场购买的7种西瓜、甜瓜和哈密瓜种子检测发现,其中新疆的哈密瓜种子86-1携带西瓜果斑病菌,与育苗发病检测的结果基本一致。 用直接PCR技术和免疫捕捉PCR技术检测番茄溃疡病菌的结果表明,具有致病性的溃疡病菌能产生614bp左右的特异性片段,而无致病性的番茄溃疡病菌、Pseudomonas、Xanthomonas、Erwinia、Burkholderia、Acidovorax及Bacillus属的19菌株无特异性片段产生。对两种检测方法的灵敏度比较发现:配制的浓度梯度菌悬液检测实验中,直接PCR技术能检测到1×10~5cfu/ml左右的悬浮液,免疫捕捉PCR技术能检测到1×10~6cfu/ml左右悬浮液。对市场购买的种子检测,未发现番茄溃疡病菌。