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目的:精神分裂症是一种复杂的大脑功能紊乱疾病,总体发病率接近1%。大量研究表明中枢神经细胞神经递质调节紊乱、遗传基因突变所致神经发育异常、神经细胞能量代谢障碍等因素与精神分裂症发生密切相关。线粒体作为调控神经细胞能量代谢重要细胞器,在神经递质合成释放、神经干细胞分化发育等重要环节都具有重要作用。本课题组离体试验研究首次发现第二代非典型抗精神分裂症药物奥氮平在神经调节蛋白1(NRG1)介导下对精神分裂症样线粒体功能障碍具有显著治疗作用。为从整体动物水平验证奥氮平以上线粒体保护作用与NRG1的关系,并进一步探索下游调控机制开展了本研究。方法:在第一部分研究中,本组采用CRISPR/Cas 9技术构建了NRG1整体敲除(NRG1 KO)小鼠模型,分别采用qRT-PCR、Western Blot和免疫组化法验证了脑内NRG1表达水平;设立野生型组(WT)、MK801组、NRG1 KO组、NRG1 KO+Olanzapine组,分别采用旷场实验检测小鼠自发活动、前脉冲抑制(PPI)法检测感觉门控功能、社交实验检测小鼠社交能力、Morris水迷宫检测小鼠学习记忆能力对小鼠行为学进行评价;使用透射电镜观察脑线粒体超微结构,使用钙离子诱导线粒体肿胀法评价脑线粒体膜通透性变化情况,并探究奥氮平对NRG1导致的线粒体异常的作用。通过以上研究从整体动物水平验证了奥氮平抗精神分裂症样线粒体损伤与NRG1的关系。本组前期研究显示NRG1通过转录后调控方式调控下游线粒体功能变化。为此在第二部分中,本课题组采用miRNA测序技术对NRG1 KO小鼠脑组织中显著变化的miRNA分子进行了无偏差测序,并进一步采用生物信息学相关技术从发生极显著变化分子中锁定与细胞能量代谢密切相关的miR-143-3p;采用qRT-PCR分别在NRG1 KO小鼠脑组织,SH-SY5Y细胞系和大鼠原代皮层神经元三个水平验证了NRG1与miR-143-3p表达的关系;在SH-SY5Y细胞系和大鼠原代皮层神经元水平建立miR-143-3p mimic和miR-143-3p inhibitor模型,采用MitoSOX Red荧光探针检测线粒体ROS,JC-1荧光探针检测线粒体膜电位,Western blot检测细胞相关蛋白表达水平,进一步明确了miR-143-3p对线粒体功能的调控作用;最后本组还验证了奥氮平对miR-143-3p的调控作用,并明确了该作用与NRG1的相互关系通过以上研究分别从离体和整体水平明确miR-143-3p是NRG1下游调控奥氮平抗精神分裂症样线粒体功能紊乱的重要靶点。为进一步明确miR-143-3p调控线粒体功能的直接靶标,在第三部分中对miR-143-3p过表达神经细胞进行mRNA测序;结合文献初筛测序结果中发生极显著性下调具有线粒体调控作用靶基因,并采用qRT-PCR进行验证;采用双荧光素酶报告探针法锁定miR-143-3p靶基因线粒体肌酸激酶1B(CKMT1B);使用Western Blot和免疫染色法进一步验证miR-143-3p与CKMT1B的调控关系。通过以上研究明确了miR-143-3p调控线粒体功能的靶基因,为后续奥氮平抗精神分裂症样线粒体功能直接靶点研究奠定了基础。结果:在第一部分中与WT组相比,NRG1 KO小鼠出现了与MK801组相似的显著性精神分裂症样行为学改变,其中包括前脉冲抑制(P<0.05),自发活动量升高(P<0.05)和社交功能障碍(P<0.05),但对学习记忆功能并未产生显著影响(P>0.05);与前期离体试验结果一致的是NRG1 KO鼠脑线粒体超微结构发生显著改变,其双层膜结构间隙变宽,内容物电子云密度显著降低,较WT组,NRG1 KO鼠离体脑脏线粒体对钙离子诱导的线粒体肿胀变化不敏感(P>0.05);奥氮平显著改善MK801诱导的小鼠神经行为与线粒体形态与功能改变(P<0.05)却对NRG1 KO导致的精神分裂症样行为异常和线粒体损伤无效。以上结果从整体动物水平证明了NRG1是调控奥氮平发挥抗精分样神经细胞线粒体功能异常的关键靶点。在第二部分中,miRNA-seq结果显示与WT相比,NRG1 KO小鼠脑组织中有46个miRNAs表达上调,143个miRNAs表达下调(P<0.05),经NRG1 KO鼠脑组织以及SH-SY5Y细胞和大鼠原代皮层神经元NRG1 KD模型qRT-PCR验证,miR-143-3p被初步认定为NRG1下游具有潜在线粒体调控作用关键靶标(P<0.05);miR-143-3p mimic和miR-143-3p inhibitor模型结果显示,较control组,miR-143-3p低表达细胞出现了显著的线粒体功能损伤,包括细胞线粒体ROS水平升高,线粒体膜电位水平降低(P<0.05);重要的是1、10μM奥氮平NRG1依赖性升高miR-143-3p表达水平,且可有效抑制miR-143-3p低表达所致的线粒体ROS水平升高及线粒体膜电位的降低(P<0.05)。以上结果表明:miR-143-3p是NRG1通路下游参与奥氮平抗精神分裂症样线粒体损伤关键靶点之一。在第三部分中,miR-143-3p过表达神经细胞mRNA测序GO富集分析结果显示,ATP酶活性的负调控(GO:0032780)、心肌细胞的收缩与信号传导(GO:0086002)和突触组织的功能(GO:0050808)等重要信号通路发生了显著变化(P<0.05),该结果进一步佐证第二部分中有关miR-143-3p调控神经细胞能量代谢相关;在有显著改变的基因中结合文献调研初步筛选获得线粒体肌酸激酶1B(CKMT1B)与PAPPA候选mRNA,通过SH-SY5Y细胞和大鼠原代皮层神经元miR-143-3p mimic和miR-143-3p inhibitor模型qPT-PCR验证,在miR-143-3p过表达发生显著性下调靶基因中筛选获得线粒体肌酸激酶1B(CKMT1B)(P<0.05);与对照组相比,miR-143-3p低表达可以使CKMT1B蛋白水平显著升高(P<0.05);双荧光素酶报告探针试验结果显示,与CKMT1B/miR NC相比,CKMT1B/miR-143-3p mimic组荧光强度显著降低(P<0.01),而CKMT1B/miR-143-3p inhibitor组荧光强度显著升高(P<0.01),该结果证明CKMT1B为miR-143-3p靶基因;Western Blot和免疫染色试验结果进一步验证了以上关系,重要的是,我们发现奥氮平可以显著降低miR-143-3p inhibitor所导致的CKMT1B细胞蛋白水平升高(P<0.05)。以上结果表明CKMT1B是miR143-3p的靶基因,其可能介导了奥氮平抗精分样线粒体功能紊乱的作用。结论:NRG1通路下游miR-143-3p是调控奥氮平抗精分样神经细胞线粒体功能异常的关键靶点之一,其线粒体调控靶基因是CKMT1B,该靶标是否参与了奥氮平的抗精分药理作用机制仍有待于进一步验证。本研究进一步拓展了我们对精分样神经细胞线粒体功能损伤分子机制的认识,发现了miR-143-3p这一潜在的奥氮平疗效关联性分子标记物,为后续临床精分患者分子分型以及个体化精准治疗提供了理论研究基础。