棉铃虫核型多角体病毒(Heliothis armigera Nuleopolyhedrovirus, HaNPV)是棉铃虫的天然病原体，对棉铃虫有特异的致死效应，不危害人畜及环境，是进行棉铃虫生物防治的好材料。国内外已广泛应用棉铃虫核型多角体病毒防治棉铃虫。棉铃虫核型多角体病毒是我国最早注册的杆状病毒杀虫剂，到1999年，约有100，000公顷棉田用棉铃虫核型多角体病毒的生物制剂防治害虫。国内已对HaNPV进行了多方面的研究，包括病毒株的分离鉴定、形态特征、病毒生物活性测定、离体细胞感染和复制、测序和功能基因研究，基因工程病毒杀虫剂的构建等；但对其复制侵染与宿主细胞互作的分子机理，目前仍缺乏足够且深入的了解。 Chariton C A & Volkman L Z于1993年研究了AcMNPV感染Sf21细胞过程中肌动蛋白的变化情况，他们发现在病毒侵染的早期(3hr p.i)，即使用放线菌酮抑制细胞蛋白合成，细胞中原有的肌动蛋白也可被脱去囊膜而进入细胞的核衣壳诱导形成缆索(cable)结构。在病毒感染的迟早期，即病毒复制DNA以前(3-6hr p.i)，细胞变园，肌动蛋白在整个细胞中都出现凝集，这种凝集可被放线菌酮(抑制细胞和病毒蛋白合成)抑制而对蚜栖菌素(抑制细胞而不抑制病毒蛋白合成)不敏感，这表明病毒早期蛋白合成有利于这种凝集而与细胞蛋白无关，并且这种凝集与细胞变园无相关性，细胞变园也可通过其他途径如秋水仙素处理而实现，但此时并无肌动蛋白凝集现象。在病毒形成对数期(6-12hr p.i)，病毒核衣壳与肌动蛋白纤丝同时存在于核内病毒发生基质中。于是他们认为核衣壳导致细胞内肌动蛋白形成缆索结构，这种结构与病毒的胞内运输及其后在核内的装配以及装配后的细胞液化、病毒释放是相关的。 以上是AcMNPV在侵染过程中其核衣壳与细胞肌动蛋白的互作关系，但研究者并没有在分子水平揭示这种互作关系的机制，即并不知道核衣壳中哪种成分、哪个基因起了作用，推测AcMNPV衣壳蛋白的最主要成分VP39的作用可能很重要。VP39蛋白是杆状病毒代表种——AcMNPV衣壳的主要组成成分，Miller等1989首先鉴定AcMNPV的晚期必需基因——编码分子量为39kD的核衣壳蛋白基因vp39，许多学者对其进行了深入的研究。VP39蛋白是杆状病毒核衣壳结构最主要成分，几乎是均匀的分布在核衣壳表面。新合成的VP39蛋白几乎全部分散在细胞质中，但经过一段时间以后(大约12小时)，大部分VP39蛋白被转移到细胞核中。最近的研究发现，AcMNPV的vp39基因与侵染密切相关。其它众多的杆状病毒的侵染过程是否也象AcMNPV那样，存在病毒衣壳与宿主细胞ACtin的互作呢?至今的报道很少，对ljaNPV这方面的知识更是空白。为此，我们借鉴前人的资料，开展了!laNPV侵染机制的研究。 本文首先用TR工201试剂从约10日个棉铃虫细胞Hz一AM 111“提取了1 .68mg总RNA，用0119。(dT)纤维素柱从总RNA中分离mRNA，然后用superscript翔Ch。iCe System for cDNA Synthesis kit试剂盒合成棉铃虫细胞Hz一AMI的eDNA:用01190(dT)，2一l，作引物，用除去了RNaseH活胜的Supersciptll RT从mRNA逆转录出cDNA的第一链，再以原有的mRNA作引物，以新合成的cDNA第一链作模板，利用￡。olj DNA Polymerase工的nick translation合成cDNA的第二链，在合成第二链的同时加入丑co了了RNasell消化fnRNA，并加入E.Coli DNA ligase将各个片段连接起来，最后用T4 DNA polymerase将双链cDNA的末端补平。用T4 DNA ligase将去磷酸化的EcoRI adaPter连接到双链cDNA的末端，并用p。lynucleotide kinase使adapter磷酸化。并用CDNASIZe fractionati()nC。lumns筛选出大一犷500}〕p的CDNA片段。最后将大一于SOObp的CDNA片段克隆到去磷酸化的载体质粒pGAD424的ECoR工位点，转化大肠杆菌DHSQ，构建成棉铃虫细胞HZ一AMI的cDNA文库。质粒pGAD424是大肠杆菌一酵母菌穿梭质粒载体，pGAD424上含有酵母菌转录激活因子GAL4蛋白激活域的编码区(GAL4一AD)。该文库中有1/6重组质粒可在酵母中表达酵母蛋白Ga14一AD与棉铃虫蛋白的融合蛋白。通过在合成cDNA第一链时参入。32PdCTP，显示出合成的CDNA为6. OKb以下的连续区带，测得文库的滴度为1.5火1。‘，可以代表亲本细胞的全部编码蛋白质的基因序列，即该文库具有代表性(representativity)。 在成功构建棉铃虫细胞Hz一AMICDNA文库的基础上，本文接着将棉铃虫核型多角体病毒衣壳蛋白VP39(HaNPV一VP39)基因克隆到酵母双杂交系统(yeasttwo一hybrid system)中的质粒pGBTg上。pGBTg上含有酵母菌转录激活因子GAL4 DNA结合域的编码区(GAL4一DBD)，使克隆到质粒pGBTg上的HaNPV一vp39基因与GAL4一DBD基因融合，在酵母菌中表达DBD一vp39融合蛋白，该融合蛋白即为酵母双杂交系统中的诱饵蛋白。然后通过酵母双杂交系统，在棉铃虫细胞CDNA文库中钓取VP39的相互作用因子基因。按CDNA文库转化法将Hz一AMI细胞cDNA文库质粒转化入酵母受体菌HF7C中。转化效率显示含有pGBT39质粒和cDNA文库质粒DNA的转化子约有1.8x10卜个。7一10d后，从SD产LeU一Trp一HIS平板上挑取1000个直径Zlnln以上的菌落划线培养于另一个新鲜的三缺SD产TrP一Leu一HI