研究目的:　　 对人胚胎干细胞进行冻存和复苏，比较-80℃冻存法、常规液氮冻存法和玻璃化冻存法对人胚胎干细胞冷冻保存的效率，以及复苏后细胞生长与分化的状态，建立高效的冻存方法。通过观察和检测人胚胎干细胞在自发分化培养条件下的细胞分化情况，探讨人胚胎干细胞自发分化培养时的分化规律。　　 研究方法:　　 1、将人胚胎干细胞进行-80℃冻存法冻存、常规液氮冻存法冻存及玻璃化冻存法法冻存，并在其冻存5d和60d时复苏。　　 2、对复苏的人胚胎干细胞进行碱性磷酸酶染色，RT-RCR分析复苏人胚胎干细胞的Oct-4、nanog、E-cadherin和Vimentin基因的表达情况。　　 3、观察自发分化培养条件下的人胚胎干细胞化学染色特性，免疫荧光染色检测自发分化培养的人胚胎干细胞上皮细胞标志(E-cadherin、CD24)和间质干细胞标志(Vimentin、CD44)的表达情况。　　 4、实时荧光定量PCR鉴定自发分化培养的人胚胎干细胞上皮细胞相关基因(E-cadherin、ZO-1)和间质干细胞相关基因(N-cadherin、Vimentin、Fibronectin)的表达情况。　　 研究结果:　　 1、不同冻存方法及冻存时间复苏后人胚胎干细胞回收率:-80℃冻存组、常规液氮冻存组、玻璃化冻存组在5d时的回收率分别为28.5％、28.3％和80％，组间比较-80℃组与常规液氮组差异无显著性意义(P＞0.05)，其余组间比较差异有显著性意义(P＜0.01)。在60d时回收率分别为7.1％、25％和73.3％，组间比较差异有显著性意义(P＜0.01)。-80℃冻存法在冻存5d和60d差异有显著意义(P＜0.01)。　　 2、不同冻存方法及冻存时间复苏后人胚胎干细胞存活率:-80℃冻存组、常规液氮冻存组、玻璃化冻存组在5d时的复苏后存活率分别为8.5％、11.6％和70％，组间比较-80℃组与常规液氮组差异无显著性意义(P＞0.05)，其余组间比较差异有显著性意义(P＜0.01)。在60d时复苏后存活率分别为0％、8.3％和66.7％，组间比较差异有显著性意义(P＜0.01)。-80℃冻存法在冻存5d和60d差异有显著意义(P＜0.05)，其余组在不同冻存时间比较差异无显著意义(P＞0.05)。　　 3、不同冻存方法及冻存时间复苏后人胚胎干细胞克隆分化程度:-80℃冻存组、常规液氮冻存组、玻璃化冻存组在5d和60d复苏后未分化率分别为有升高的趋势。　　 4、不同冻存方法及冻存时间复苏后人胚胎干细胞生物学特征鉴定:常规液氮冻存组、玻璃化冻存组复苏后第6代人胚胎干细胞ALP表达阳性，通过RT-PCR检测Oct-4、nanog、E-cadherin和Vimentin基因的表达情况与未冻存组比较无明显差异。　　 5、人胚胎干细胞自发分化培养:人胚胎干细胞自发分化培养早期，通过镜下观察到胚胎干细胞边缘开始呈上皮样细胞分化，然后上皮样细胞分化为间质干样细胞。无饲养层人胚胎干细胞自发分化细胞团块呈现中心向边缘的ALP和PAS染色阳性逐渐减弱的趋势。免疫荧光结果显示上皮样细胞向间质干样细胞分化过程中，CD24表达从阳性逐渐表达减弱，甚至阴性，CD44表达由阴性逐渐呈阳性。人胚胎干细胞自发分化的上皮样细胞E-cadherin、ZO-1表达量明显高于间质干样细胞，而N-cadherin、Vimentin、Fibronectin在上皮样细胞表达明显低于间质干样细胞。　　 6、人胚胎干细胞自发分化传代细胞:P1代上皮样细胞的E-cadherin和Vimentin免疫荧光染色都呈阳性;P2代不规则细胞的E-cadherin阳性明显开始减弱，Vimentin的表达增强;P4代细胞E-cadherin阴性，Vimentin强阳性。随着传代次数增加，E-cadherin、ZO-1表达量呈先上升后下降的趋势，而N-cadherin、Vimentin、Fibronectin表达量呈上升趋势，Oct-4的表达量总体呈下降趋势。　　 结论:　　 1、玻璃化冻存法是目前冷冻保存人胚胎干细胞相对高效的方法，复苏后的干细胞在继续培养过程中仍可保持其正常的生物学特性。　　 2、人胚胎干细胞在自发分化培养过程中可能进行了上皮间质转化的过程。