本研究采用免疫学技术、微生物学技术、蛋白质技术等提取哈氏弧菌(Vibrio harveyi)主要保护性抗原外膜蛋白(Outer membrane protein,OMP)和脂多糖(Lipopolysaccaride,LPS),并分析了其结构组成、免疫特性,探讨培养及提取条件对OMP表达的影响;同时以大黄鱼(Pseudosciaena crocea)为试验对象,初步研究了保护性抗原对大黄鱼免疫机能的影响。主要结果如下: 1.分别采用Sarkosyl法和改进的酚水法提取V. harveyi OMP和LPS,利用SDS-PAGE、免疫印迹(Western-blot)试验分析其种类组成和免疫反应性。结果表明,3种血清型菌株来源的OMP主要由分子量为31kD-43kD的条带组成,LPS主要条带的分子量分布在20kD-120kD范围内;各菌株间LPS和OMP其SDS-PAGE图谱差异明显,但均存在共同条带。吸附后的兔抗V. harveyi与3菌株来源的OMP的免疫印迹反应存在差异,分别表现出2条和1条免疫反应带;其中64kD反应带为3菌株共有:3菌株LPS的Western-blot结果有较大差异,分别表现了7条、2条和4条免疫反应带,其中31kD LPS为3菌株共有。 2.经不同培养时间提取的LPS,在0h-48h内产量逐渐增加;LPS电泳图谱存在差异,30h时间点表现出更多的蛋白条带及免疫反应带;所有时间点的LPS具有两条共同的印迹带(31kD和52kD);各个时间点提取的OMP电泳图谱无明显变化,免疫印迹显示主要有一条共同反应带(64kD)。研究结果表明,培养时间对OMP的表达和免疫反应性没有明显影响;而对LPS的产量、表达种类和免疫反应性均有较大的影响,培养30h左右提取的LPS免疫特异性最强。 3.在不同的培养及提取条件下,提取V. harveyi外膜蛋白,经过SDS-PAGE分析发现,在不同培养时间、不同培养方式、不同pH值和无Fe培养基条件下提取的OMP电泳图谱无明显差异,主要条带为74kD、42kD、40kD、37kD、34kD。不同培养温度下提取OMP图谱有差异,差异不大。利用4种方法提取OMP,用蛋白酶抑制剂PMSF提取OMP,图谱条带最多:SDS提取的OMP图谱条带最少且不清晰;而Sarkosyl法与Triton X-100相比,差异并不明显,Triton X-100抽提的OMP高分子量区域条带较多。结果表明,提取OMP的最适宜细菌培养条件和提取方法为:培养基pH值6.5-7.6,振荡培养,培养温度25℃-34℃,培养时间24h-36h,提取方法采用Sarkosyl法。 4.采用代表不同血清型的3株V. harveyi菌株,分别制备LPS、OMP和福尔马林灭活FKC,作为免疫原,注射接种大黄鱼,免疫接种不同时间后,测定受免鱼血清中凝集抗体效价、血清溶菌酶活性和血液白细胞吞噬活性,28d后测定免疫保护力,结果表明,3种抗原对大黄鱼均有较强的免疫原性。免疫组血清凝集抗体效价逐渐增高,28d时最高;溶菌酶活性21d达到峰值,随后逐渐下降;白细胞吞噬活性7d后迅速增高,14d后缓慢升高,21d达峰值,随后下降。受免后7d、14d、21d、