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研究目的:构建卵巢癌微环境基质金属蛋白酶与ATP双重响应性纳米给药系统。将盐酸阿霉素(doxorubicin hydrochloride,DOX)嵌入富含C≡G碱基对的DNA双螺旋结构完成载药,以提高其在治疗卵巢癌的疗效,减少毒副作用。实验方法:1.建立盐酸阿霉素的直接荧光分析方法;2.制备肿瘤微环境响应性纳米胶束:以基质金属蛋白酶-9(Matrix metalloproteinase-9,MMP-9)的特异性裂解底物多肽(GPQGIAGQR)作为连接臂,连接聚乙二醇(Polyethylene glycol,PEG)与ATP响应性核酸适配体(Aptamer,apt)的互补DNA(complementary DNA,c DNA),再与连接了聚己内酯(Polycaprolactone,PCL)的apt杂交互补,得到具有MMP-9与ATP双响应性的聚合物,在水溶液中自组装成纳米胶束(nanomicelle,NM)PCL-DNA-Peptide-PEG。将盐酸阿霉素嵌入DNA双螺旋结构的C≡G碱基对之间,制得纳米胶束PCL-DNA/DOX-Peptide-PEG。另制备了ATP响应性的纳米胶束PCL-DNA/DOX-PEG。分析纳米胶束的表征(粒径、电位、表面形态等)及载药结合和药物释放行为等;3.CCK-8法检测纳米胶束对小鼠卵巢上皮肿瘤细胞ID-8的存活能力影响;4.共聚焦显微镜定位分析ID-8细胞对纳米胶束的摄取;5.流式细胞术定量分析ID-8细胞对纳米胶束的摄取;6.TUNEL法对摄取了纳米胶束的ID8细胞进行凋亡分析。结果:1.应用荧光分光光度计建立了DOX体外检测方法,DOX浓度在0.08-4.93μM范围内与荧光强度有线性关系,R2=0.998,该方法简单,精确,满足实验需求;2.采用成肽反应制备纳米胶束,MMP-9底物多肽连接PEG与c DNA,与连接了PCL的apt杂交互补,同时嵌入DOX,自组装形成双重响应性纳米胶束PCLDNA/DOX-Peptide-PEG(ATP&MMP组)。同法制备单响应性纳米胶束PCLDNA/DOX-PEG(ATP组)。两种纳米胶束粒径分布均匀,大小相近,载药结合率与药物释放行为一致;3.CCK-8法检测不同浓度的载体对ID-8细胞增殖无差异性影响,P=0.099>0.05,R2=0.305;载体对ID-8细胞的细胞存活率为79.9±1.0%;不同浓度DOX制剂对ID-8细胞的存活率有显著统计学意义,P=0.000<0.001,R2=0.976;不同给药组别细胞毒性比较:ATP&MMP组≈ATP组>Free DOX组;4.共聚焦显微镜观察载药胶束组的DOX集中于细胞核,游离给药DOX集中于细胞质,ID-8细胞对载药胶束摄取较快。半定量分析ID-8细胞对不同处理方式DOX摄取有极其显著的统计学差异,P=0.000<0.001,R2=0.996,即ID-8对DOX摄取量Free DOX组>ATP&MMP组>ATP组;5.流式细胞学分析不同组别的胞内DOX平均荧光强度有显著性差异,P=0.000<0.001,R2=0.962,即ID-8对DOX摄取量Free DOX组>ATP&MMP组>ATP组。结果与共聚焦显微镜分析相一致;6.TUNEL法分析不同处理方法ID-8细胞凋亡情况有显著性差异,P=0.000<0.001,R2=0.996;两两比较结果,ATP&MMP组高于ATP组和Free DOX组,P值相同,P=0.000<0.001,而ATP组稍高于Free DOX组但是两组间无差异,P=0.570>0.05。结论:所制备的自组装双重响应性纳米胶束PCL-DNA/DOX-Peptide-PEG具有良好的粒径大小,稳定性,无明显细胞毒性,抗肿瘤效果,预期有良好的肿瘤组织渗透能力,较少的正常器官毒副作用。为该卵巢癌肿瘤微环境双重响应性给药系统的体内评价打好实验基础,肿瘤微环境双重响应性纳米药物PCL-DNA/DOXPeptide-PEG或许能成为治疗卵巢癌的方法之一。