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目的:探索苯海索(Trihexyphenidyl,THP)对大脑中动脉阻塞(Middle cerebral artery occlusion,MCAO)大鼠血脑屏障(Blood-brain barrier,BBB)上Occludin变化的影响及其相关机制研究。方法:(1)选用250 g-280 g的雄性SD大鼠,运用改良的Longa线栓法进行制备MCAO模型。利用神经学Longa评分细则进行判断神经功能缺损程度,选用Longa评分≥2的SD大鼠进行后续实验。给药组在手术前30 min腹腔注射THP,造模8 h后,采用神经功能损伤评分(Modified neurological severity scores,m NSS)系统评估大鼠神经功能,用2,3,5—氯化三苯基四氮唑(2,3,5-Triphenyte-trazoliumchloride,TTC)染色并统计脑梗塞体积;细胞免疫荧光鉴定大鼠脑微血管内皮细胞(Rat brain microvascular endothelial cells,r BMECs);MTT检测THP对r BMECs细胞毒性以及THP对氧糖剥夺(Oxygen glucose deprivation,OGD)损伤后的r BMECs存活率影响。(2)使用荧光素钠(Fluorescein sodium,Na F)检测MCAO大鼠血脑屏障通透性变化;利用罗丹明123(Rhodamine123,Rh123)检测MCAO大鼠脑微血管P-糖蛋白(P-glycoprotei,P-gp)的活性;大鼠脑组织活性氧簇(Reactive oxygen species,ROS)含量由DCFH-DA检测;使用r BMECs与星形胶质细胞共培养建立体外BBB模型,每日检测跨内皮电阻(Transendothelial electrical resistance,TEER);通过测定Na F从内室到外室和从外室到内室自由扩散的表观通透系数(Apparent permeability coefficient,Papp)研究THP对BBB通透性的影响;通过测定Rh123从内室到外室和从外室到内室转运的Papp值研究THP对BBB上P-gp活性的影响;免疫荧光染色检测OGD损伤对星形胶质细胞的影响;流式细胞术检测OGD损伤对r BMECs内ROS水平的影响。(3)免疫荧光检测THP对MCAO大鼠脑微血管上S1PR2,CRHR1,Erk1/2,p38,c PLA2,MMP-9,Occludin及磷酸化分子变化的影响。(4)细胞免疫荧光与Western Blot检测THP及抑制剂对OGD损伤后S1PR2,CRHR1,P-Erk1/2,P-p38,P-c PLA2,MMP-9与Occludin变化的影响。结果:(1)m NSS神经功能评估结果显示,在给药剂量为1 mg/kg时,THP显著降低MCAO大鼠m NSS评分。与模型组相比,给药剂量为0.75 mg/kg、1 mg/kg时,THP能显著减少大鼠脑组织梗塞体积;Ⅷ因子免疫荧光染色结果显示,r BMECs成功提取分离;THP对r BMECs细胞没有明显细胞毒性;NAC与THP均能提高OGD损伤后r BMECs的存活率,其中THP的最佳浓度为1μM。(2)在给药剂量为0.75 mg/kg、1 mg/kg时,THP显著降低Na F,Rh123在脑室的累积和脑组织ROS水平;TEER值处于稳态时证明体外血脑屏障模型成功建立;OGD损伤BBB的完整性,引起TEER值降低,NAC和THP保护BBB的完整性使TEER值增高;THP降低OGD损伤后Na F从内室到外室和从外室到内室的Papp值,减少OGD损伤后Rh123从内室到外室的转运,提高OGD损伤后Rh123从外室到内室的转运,说明了THP降低了BBB的通透性,保护BBB的完整性;OGD损伤后,星形胶质细胞的红色荧光增强,说明星形胶质细胞被激活。OGD损伤引起细胞内ROS水平升高,NAC与THP 1μM,THP10μM预处理组显著降低OGD损伤后的ROS水平。(3)组织切片的免疫荧光结果显示,Occludin的表达水平与S1PR2,CRHR1,P-Erk1/2,P-p38,P-c PLA2,MMP-9的激活呈负相关;S1PR2,CRHR1,P-Erk1/2,P-p38,P-c PLA2,MMP-9在模型组中的表达水平高于空白组,但Occludin在模型组中的表达水平低于空白组,与模型组相比,THP抑制了S1PR2,CRHR1,P-Erk1/2,P-p38,P-c PLA2,MMP-9的表达,促进了Occludin的表达;Erk1/2,p38,c PLA2在各组中的表达无明显变化。(4)利用细胞免疫荧光与Western探索THP对OGD损伤后r BMECs上S1PR2,CRHR1,P-Erk1/2,P-p38,P-c PLA2,MMP-9和Occludin表达变化的影响。结果显示,Occludin的表达水平与S1PR2,CRHR1,P-Erk1/2,P-p38,P-c PLA2,MMP-9的激活呈负相关;与模型组相比,给药组显著上调紧密连接蛋白Occludin的表达。OGD损伤后,S1PR2,CRHR1,P-Erk1/2,P-p38,P-c PLA2与MMP-9的表达水平均上调,但这一现象被NAC与THP逆转;通过抑制S1PR2,CRHR1,Erk1/2,p38,c PLA2,MMP-9及磷酸化分子的表达,提高r BMECs上Occludin的表达水平。结论:(1)THP对MCAO大鼠具有保护作用,通过降低脑组织内过量产生的ROS,抑制S1PR2,CRHR1,Erk1/2,p38,c PLA2,MMP-9的激活与磷酸化,上调Occludin的表达进而降低BBB的通透性。(2)THP通过降低r BMECs内ROS水平,进而上调BBB上Occludin的表达,降低BBB的通透性,其机制可能与S1PR2/c PLA2/Occludin通路有关。