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出膜是鱼类孵化过程中最为关键的环节,已有研究表明孵化酶在鱼类孵化出膜过程中起关键作用。白梭吻鲈(Sander lucioperca)属于鲈形目(Perciformes)、鲈科(Percidae)、梭吻鲈属(Sander),是一种极具养殖潜力的亚冷水性凶猛鱼类。在进行该鱼人工繁殖过程中,我们发现部分胚胎能正常机械运动,但过了平均出膜时间后,却不能正常出膜,最终死在卵膜里面,推测白梭吻鲈胚胎不能正常出膜与其孵化腺的发生和孵化酶的表达有关。本研究采用显微、超微观察方法探究了白梭吻鲈孵化腺发生规律;通过孵化酶基因克隆、实时荧光定量PCR、原位杂交等方法,从分子水平探究孵化酶基因在胚胎孵化出膜过程中的时空表达模式;制备了白梭吻鲈孵化酶多克隆抗体。本研究旨在阐明白梭吻鲈胚胎发育过程中孵化腺的发生、孵化酶基因的表达模式,为后续更为深入地探究白梭吻鲈出膜机制奠定基础。研究结果如下:1白梭吻鲈胚胎、仔鱼孵化腺的组织学观察通过光镜及扫描电镜观察分析了白梭吻鲈各时期胚胎及仔鱼的孵化腺(HG)动态变化过程。结果显示孵化腺细胞(HGC)最早出现在肌节出现期,光镜下HGC被染成粉红色,主要分布在胚体头部腹面与卵黄囊连接处和胚体背部;扫描电镜下发现HGC开始突破表皮细胞形成相互交织的嵴状区。肌肉效应期和心跳期HGC显著变大、增多,此时HGC短径为4-6 μm,长径为8-10 μm,广泛分布在胚体的头部、背部、尾部、眼囊附近以及卵黄囊表面,该阶段还观察到大量的HGC分泌出颗粒状的孵化酶(HE),这些HE粘在一起呈白色的团状物。白梭吻鲈胚胎发育至出膜期,HGC开始衰退、消失,光镜下HGC颜色变淡,扫描电镜下HGC开始凹陷,细胞内物质已经排出。仔鱼期HGC已经消失,光镜下能观察到1日龄仔鱼HGC消失后留下的空泡,扫描电镜下能观察到分泌HE后留下的孔洞;发育至4日龄这些孔洞已被修复,仔鱼身上只能见到完整的上皮细胞。2白梭吻鲈高卵壳裂解酶(HCE)基因的克隆及生物信息学分析根据本实验室已有白梭吻鲈转录组测序数据中的HCE cDNA的部分序列信息,设计引物,再分别进行5’端和3’端快速扩增(RACE)获得HCE cDNA全长,并进行生物信息学分析。白梭吻鲈HCE基因长度为1189 bp,包括42 bp 5’-UTR和271 bp 3’-UTR,ORF序列长876 bp。一共编码291个氨基酸,包含21个信号肽、53个前肽序列和217个成熟肽,成熟肽中含有虾红素蛋白酶家族的特征序列(HE××H××GF×HE××R×DR)。分子质量为 33138.47 Da,等电点为9.50,不稳定性指数为43.03。白梭吻鲈HCE蛋白高级结构预测发现该蛋白包含3个α-螺旋和4个β-折叠,其中特征结构“HExxH”是与锌离子结合的重要区域。遗传进化分析表明白梭吻鲈HCE与黄金鲈同源性最高,然后与其他鱼类、两栖动物以及鸟类合并成一个脊椎动物进化分支。3白梭吻鲈低卵壳裂解酶(LCE)基因的克隆及生物信息学分析根据本实验室已有的白梭吻鲈转录组测序数据中的LCE cDNA的部分序列信息,设计引物,再分别进行5’端和3’端快速扩增(RACE)获得LCE cDNA全长,并进行生物信息学分析。LCE cDNA序列全长1147 bp,包含200 bp 5’-UTR,149 bp 3’-UTR(包含一个 poly A 尾端),798 bp ORF 序列,编码 265 个氨基酸,包含21个信号肽、45个前肽序列和199个成熟肽,成熟肽中含有虾红素蛋白酶家族的特征序列(HE××H××GF×HE××R×DR)。理论分子质量为29851.40 Da,理论等电点为8.09,不稳定性指数为41.22。白梭吻鲈LCE蛋白高级结构预测发现该蛋白包含3个α-螺旋和4个β-折叠,其中特征结构“HExxH”是与锌离子结合的重要区域。遗传进化分析表明白梭吻鲈与黄金鲈形成一个鲈形目的进化分支,然后与其他鱼类、两栖动物、鸟类合并成一个脊椎动物进化分支。4白梭吻鲈HCE和LCE基因的时空表达根据已克隆的HCE和LCE cDNA序列设计实时荧光定量PCR引物和原位杂交探针,选取不同发育时期的白梭吻鲈胚胎及仔鱼作为样本,再分别检测不同时期HCE和LCE mRNA的表达量和转录位置。结果表明在囊胚期和原肠胚期,HCE和LCE mRNA表达量极低,组织原位杂交无阳性信号。胚胎发育至肌节出现期,HCE和LCE mRNA表达量迅速上升,其中LCE mRNA直接达到峰值,HCE和LCE mRNA转录本主要集中在胚胎头部前额和腹面与卵黄囊连接处。从肌节出现期到心跳期HCE和LCE mRNA都维持较高水平的表达,HCE mRNA在该阶段逐渐上升并在心跳期到达峰值,原位杂交显示心跳期HCE和LCE mRNA表达最为明显,整个白梭吻鲈胚体头部、背部、尾部及卵黄囊表面均能检测到阳性信号。发育至出膜期HCE和LCE mRNA表达量显著下降,但其转录本分布位置依旧广泛。仔鱼期基本检测不到HCE和LCE mRNA的表达。5白梭吻鲈HCE、LCE多克隆抗体制备本试验利用已经克隆出来的HCE和LCE cDNA序列信息并结合生物信息学分析,分别设计1条含有15个氨基酸序列组成的多肽作为抗原,活化抗原后免疫新西兰兔制备HCE、LCE多克隆抗体,再应用酶联免疫吸附方法(ELISA)检测抗体效价。ESI-MS图谱结果表明所测HCE、LCE合成多肽分子量与其计算的理论值相对分子量相匹配;高效液相分析结果显示HCE、LCE均为单峰,表明HCE、LCE合成多肽具有较高的纯度;制备的HCE、LCE多克隆抗体的ELISA 效价均高于 1:1,000,000。