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土霉素作为一种广谱抗生素,具有良好的抗菌和促生长作用,已被作为饲料添加剂广泛应用于畜禽养殖业中。土霉素被动物体摄入后,仅有少量残留于动物组织中,另外大部分则以原型或代谢产物的形式经粪尿等排泄物进入到环境中,将不可避免的对环境中的微生物群落造成影响。反硝化作用(Denitrification),作为自然界氮循环过程中必不可少的重要环节,对于减轻水体环境中过量活性氮引起的富营养化起着至关重要的作用,然而这一过程正受到来自环境中残留抗生素等因素的干扰。为了评估土霉素残留对水体环境中反硝化微生物群落的影响,本实验通过构建室内水体沉积物环境体系的土霉素暴露胁迫模型,对土霉素暴露胁迫下沉积物中微生物群落结构、功能与遗传多样性、反硝化进程及其主要功能基因响应特征进行系统研究。分别设置土霉素处理组(1.0μg/L)和空白对照组,于给药后第1d、4d、16d和30d分别采集沉积物样品,运用实时荧光定量法检测各主要反硝化功能基因的丰度,通过TRFLP技术分析反硝化功能基因多样性变化,使用HiSeq4000 PE150测序平台进行宏基因组测序研究菌群结构和功能多样性变化。结果显示,土霉素的暴露胁迫极显著的降低了沉积物中nirK和nosZ基因的相对丰度(p<0.001),其中空白对照组的基因拷贝数最高可达土霉素处理组的4倍以上。土霉素的添加对nirS基因和narG基因的相对丰度无明显影响。对nirS、nirK和nosZ基因进行末端限制性片段分析发现土霉素的添加显著改变了nirK型反硝化微生物的群落结构组成。在实验前中期,土霉素处理组与空白对照组中nosZ型反硝化微生物的群落结构组成差异明显,而到了实验后期土霉素处理组逐渐恢复到空白组水平。对本实验中沉积物样品进行宏基因组测序,菌群注释结果显示,沉积物中门水平优势细菌有变形杆菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)和放线菌门(Actinobacteria)。土霉素处理组的变形杆菌门和放线菌门的相对丰度均显著高于空白对照组(P<0.05),而厚壁菌门的相对丰度显著低于空白对照组(P<0.05)。功能注释结果显示:土霉素暴露胁迫显著降低了沉积物中微生物“蛋白质代谢”相关功能基因的丰度,且土霉素处理组中参与反硝化的功能基因相对丰度要明显低于空白对照组;同时土霉素暴露胁迫可显著降低硝酸还原酶、亚硝酸还原酶、一氧化二氮还原酶和固氮酶的丰度,但增加了一氧化氮还原酶的丰度。反硝化功能基因宿主分析结果显示共有23个细菌菌属参与沉积物中反硝化过程,其中假单胞菌属(Pseudomonas)是唯一携带全部四个反硝化功能基因的细菌宿主。相关性分析结果表明nirS基因丰度与硫碱弧菌属(Thioalkalivibrio)丰度存在显著相关性(R=0.733,P=0.038);nirK基因丰度与短根瘤菌属(Bradyrhizobium)(R=-0.905,P=0.002)和河氏菌属(Hahella)(R=-0.823,P=0.012)丰度呈显著负相关;而nosZ基因丰度与食酸菌属(Acidovorax)(R=0.785,P=0.021)丰度呈显著正相关,与海杆菌属(Marinobacter)(R=-0.753,P=0.031)丰度呈显著负相关。以上结果表明水体环境中的土霉素残留可影响沉积物中反硝化相关进程,进而可能加剧水体中活性氮的污染情况。