急性放射病(acute radiation sickness ARS)是受照机体的全部或大部分在数秒至数日内受到≥1Gy的电离辐射所引起的一种全身损伤性疾病。机体受到1-10Gy射线照射后,骨髓等造血组织的损伤是决定疾病发展的基本损伤。主要表现为骨髓造血功能受抑或衰竭,全血细胞减少,加之小血管壁的放射损伤,导致广泛的出血和感染,危及生命。鉴此,减轻造血器官的损伤、促进造血重建是治疗ARS的关键。间充质干细胞(mesenchymal stem cells MSCs)是骨髓造血微环境的主要组成细胞,除本身可分泌许多造血生长因子促进造血恢复外,MSCs可增殖、分化填补受损基质细胞,修复造血和免疫器官微环境,支持造血;同时尚具有器官特异性分化潜能,可以促进ARS后多器官损伤的修复;且由于MSCs免疫原性低,与造血干细胞共输治疗各种血液病时可以降低移植后GVHD的发生率。这些独特的生物学性能使MSCs在组织工程、细胞移植、基因治疗等领域具有十分广阔的应用前景。近年来,有研究发现除粘附状态的MSCs外,非粘附骨髓细胞(non-adherent bone marrow cells NA-BMCs)中还存在着一种更原始的基质干细胞。此种非粘附骨髓源干细胞(non-adherent bone marrow-derived stem cells NA-BMSCs)常规培养条件下可以分化为贴壁的间充质干细胞(非粘附源间充质干细胞NA-MSCs),而NA-MSCs在一定的诱导条件下可以进一步分化为骨、脂肪、神经等;更有研究者认为NA-BMSCs可能是造血干细胞及间充质干细胞的共同干细胞,其生物学特性及其组织重建的功能有待进一步研究。鉴此,我们通过反复转移的方法分离人胎儿骨髓中NA-BMSCs,分析NA-MSCs与MSCs的异同点,并建立急性骨髓型放射病小鼠模型,深入探讨NA-BMSCs在急性骨髓型放射病救治中的作用及可能机制。第一部分非粘附骨髓源干细胞的培养及鉴定目的观察人胎儿骨髓中是否存在NA-BMSCs,并探讨NA-BMSCs生物学特性及与MSCs的异同点。方法分离人胎儿四肢长骨,冲出骨髓并接种于培养皿,24小时后转移未贴壁的NA-BMCs到新的培养皿中继续培养,共转移四次,首次贴壁的细胞即为MSCs,最后一次转移后所得贴壁细胞即为NA-MSCs。取第7代的两种细胞,MTT法绘制两种细胞的生长曲线,流式细胞仪检测其细胞周期及表面标记物的表达,并分别用油红O及VonKossa试剂盒鉴定细胞的成脂、成骨分化能力。结果反复转移的NA-BMSCs可以不断形成具有贴壁能力的MSCs,并进一步分化为成纤维细胞样细胞并形成集落,即(CFU-F)。NA-BMSCs贴壁后的形态与MSCs极为相似,反复多次传代后仍具有较强的增殖潜能和多向分化潜能;表型分析显示两类细胞均不表达CD14、CD34、CD45等造血细胞表面标志,低表达CD106,高表达CD29及间充质干细胞表面标志CD105、CD73等,并极低表达与移植物抗宿主病相关的因子HLA-DR。然NA-MSCs的生长速度明显快于MSCs,培养13代后仍保持较强的分裂速度;且NA-MSCs具有较高的成骨分化能力。结论人胎儿骨髓中存在NA-BMSCs;NA-MSCs可进一步分化为MSCs,证实骨髓非粘附细胞中存在较MSCs更早期、具有多向分化潜能的干细胞。第二部分非粘附骨髓源干细胞救治急性骨髓型放射病小鼠的实验研究及机制探讨目的研究NA-BMSCs在急性骨髓型放射病救治中的作用,并探讨可能的作用机理。方法BALB/c小鼠受8.5Gy一次性全身均匀x线照射后随机分成移植组和照射对照组,移植组小鼠在照后2h内经尾静脉输注含3×106 CFDA-SE标记的人胎儿NA-BMSCs来源的NA-MSCs的细胞悬液0.3ml,照射对照组小鼠在照后2h内经尾静脉输注0.3ml生理盐水。观察小鼠照后60d存活率、不同时间点各组小鼠外周血象变化、骨髓病理变化及骨髓中新生血管形成情况。结果照后60d移植组小鼠存活率(14/21)明显高于对照组(2/21);且与对照组相比,移植组小鼠外周血白细胞计数下降慢且恢复迅速,照后14d左右达最低,照后30d基本恢复至正常水平。照后21d,移植组骨髓增生活跃,骨髓腔内新生造血灶显著多于对照,血管密度(31.7±3.61)亦显著高于对照组(11.2±2.33)。结论人胎儿NA-BMSCs可以促进急性骨髓型放射病小鼠骨髓内新生血管形成,从而改善急性放射病小鼠的造血功能。