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无细胞蛋白表达体系是一种体外合成蛋白质的开放系统，没有细胞结构的限制，因此，与传统体内蛋白表达系统相比，在蛋白质合成方面具有许多优势，如反应条件容易控制，操作简单方便，容易实现高通量反应等。本文主要开展无细胞体系同时合成多种细胞壁肽聚糖合成酶并用于体外重建胞壁酸合成途径的研究，探索无细胞蛋白质合成技术在体外合成生物学和无细胞生物学方面的应用潜力。 细胞壁肽聚糖合成途径的相关酶蛋白在大多数细菌中保守度高，是开发广谱新抗生素的重要靶点。然而，传统胞壁酸合成途径存在于细胞质内，难以用传统方法进行抑制剂的高效筛选。本论文在体外无细胞蛋白合成体系中，通过添加胞壁酸合成酶基因PCR产物作为线性模板，实现了6种关键酶基因(MurA-MurF)的可溶性共表达。进一步加入MurA-MurF所需的各种底物后，采用HPLC检控每一步酶反应的中间产物，并使用HPLC-ESI-MS测定各个中间产物的性质，确证了这一多酶反应终产物（UDP-MurNAc-L-Ala-γ-D-Glu-meso-2，6-diaminopimeloyl-D-Ala-D-Ala）。这一研究工作不仅实现了胞壁酸合成途径的体外重构，而且将多靶点抗生素高通量筛选方法从体内向体外方向转变。 反义寡核苷酸在细菌的代谢调控和生物医药领域都有重要的应用价值。本课题利用体外构建的胞壁酸合成途径，开展高效筛选能有效抑制MurA-MurF表达的反义寡核苷酸的研究。首先通过计算机辅助识别目标mRNA结构的模拟，针对以上6种目标酶蛋白基因共设计27条反义寡核苷酸，然后检测各种反义寡核苷酸对目标蛋白表达的抑制作用。结果表明，在设计的27条反义寡核苷酸中，有10条寡核苷酸对各自目标基因表达的抑制作用达到了90％以上。然后重点研究了反义寡核苷酸A281和B139分别对MurA和MurB的抑制剂量效应。结果表明，当目标基因线性模板浓度为10 ng/μL条件下，40μM反义寡核苷酸能够完全抑制MurA或MurB的表达，从而在体外实现对胞壁酸合成途径的阻断。这一工作进一步佐证了这一复杂多酶催化途径在无细胞体系中的成功重建，而且这些筛选出的反义寡核苷酸具有成为新抗菌药物的潜力。 无细胞体系的合成效率和相应试剂盒的工具性是制约无细胞蛋白质合成技术广泛应用的关键性抑制因素。在实验室长期的无细胞体系制备基础上，通过在无细胞制备宿主中表达肌酸激酶和T7 RNA聚合酶，能够简化无细胞体系的制备和降低成本，可应用于无细胞蛋白质合成试剂盒研制。同时构建了无细胞连续交换连续反应的表达系统，并制作了基于24孔板的CECF无细胞反应器，能够用于多种蛋白质的高效合成。 总之，本文工作不仅在无细胞体系中发展了多种酶蛋白同时表达的新技术，而且应用这一新技术构建了一条多酶催化体外合成胞壁酸的代谢途径，并应用于反义寡核苷酸高效筛选方法学的研究。