猪繁殖与呼吸综合征病毒的分子流行病学调查及其GP5蛋白单克隆抗体制备

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猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)是一种有囊膜的单股正链RNA病毒,属套式病毒目(Nidovirales),动脉炎病毒科(Arteriviridae),动脉炎病毒属(Arterivirus)。猪高致病性蓝耳病(Highly pathogenic Porcine reproductive and respiratory syndrome,HP-PRRS)是PRRSV引起的严重危害全球养猪业的一种RNA病毒性传染性疾病,以导致呼吸道疾病和母猪繁殖障碍为主。中国2006年4月南方地区暴发了猪高致病性蓝耳病,主要表现持续高热、食欲废绝、蓝耳、身体发绀、腹泻等临床症状,发病率和死亡率都非常高,传播速度快,迅速波及全国大部分省份,经济损失严重。  2013年以来,全国各地猪场先后发现重组毒株。为了了解猪蓝耳病在浙江及周边地区的流行情况,本研究采集2013-2015年期间浙江、河南、四川、江西、甘肃、安徽、广东、福建、湖南和上海10省市发病猪场的205份病料,并对其进行检测,病料PRRSV的阳性率为33.2%(68/205),对其中21个阳性病料中PRRSV GP5基因、Nsp2基因进行扩增和测序,将测得的序列和本实验室2006-2008年测得的9条GP5序列、9条Nsp2序列一起进行分析,系统进化分析表明:所分析的毒株序列中,23株处于JXA1类似的亚型群,有1株SX071226属于美洲经典毒株VR2332亚群,另外HZL1501,ZJXS1501,ZJXS1412,ZJSX1503,XS070425,SH061130这6个毒株处于中间过渡态群里。JXA1-like群又可以分为两支,其中一支与JXA1亲缘关系较近,主要是2014-2015年的毒株,另外一支与JXA1亲缘关系较远,主要是2006-2008年的毒株。本研究发现来自四川、上海、江西、福建、浙江、甘肃、安徽和广东8个省的猪场主要流行这3种类型的毒株,而且以JXA1为代表的HP-PRRSV仍然是优势毒株,其次是中间过渡群毒株。重组分析表明,中间过渡态群里的HZL1501是由JXA1,NADC30,GM2这三株毒重组而来。在本研究中也首次发现,FJNA1502Nsp2的481-485aa缺失,之前尚未有报道,HZL1501Nsp2的15-24aa的缺失也是第一次发现。这些结果表明,目前流行于上述省市的PRRSV毒株发生了新的变异。  以原核表达的PRRSV GP5截短蛋白为抗原免疫Balb/c小鼠制备抗GP5蛋白的单克隆抗体。利用细胞融合技术和有限稀释方法得到了4株稳定分泌抗GP5蛋白抗体的单克隆细胞1D1、1D2、2E1和2H7,间接免疫荧光和Western blot检测显示,鼠抗GP5蛋白的4株单抗能与PRRSV野毒株感染的细胞发生特异性反应。亚型鉴定2H7的重链为IgG2a,2E1的重链为IgG2b,1D1和1D2的重链为IgG1,四株单抗轻链均为κ链。  用Marc145细胞培养病毒的方法从临床病料中分离到一株疑似蓝耳病毒ZJXS1412,细胞病变表现为细胞的堆积,圆缩,脱落和迅速崩解。进一步测完其全基因组序列,从GP5和Nsp2基因序列分析发现ZJXS1412和HZL1501毒株同属于中间过渡群;而全基因组序列的遗传分析表明,ZJXS1412可能处在一个新的亚群中。
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