高盐是限制作物生长、发育和产量的最严重的非生物胁迫之一。由于土壤盐渍化的日趋严重,提高作物的耐盐性已成为一个日益紧迫的研究课题。然而,由于耐盐反应是一个极为复杂的过程,过去通过传统的育种和遗传工程取得的成功非常有限。随着分子生物学及生物技术的迅速发展,已经发现了一些与耐盐相关的新基因,并对这些基因的表达方式及其在耐盐反应中的作用已逐步了解,这为转基因工程提供了新的材料。目前,通过控制耐盐相关基因在植物体内的表达,已获得了一些提高耐盐性的转基因植物。国内已有应用拟南芥液泡膜Na~+/H~+逆向转运蛋白基因(AtNHX I)转化玉米和小麦等农作物,并获得了耐盐能力相对提高的转基因植株的文献报道,这表明应用AtNHX I基因培育耐盐作物品系具有广阔的前景。 紫花苜蓿(Medicago sativa L)作为一种价值最高的优质豆科牧草,在我国西北和华北地区的种植面积很广泛。由于在畜牧业中占有极其重要的地位,利用基因工程技术来提高苜蓿耐盐性,期望获得优良抗逆新品系,这对我国牧草业的发展有重要的现实意义。 本研究将克隆所得的拟南芥液泡膜Na~+/H~+逆向转运蛋白基因,添加了植物表达CaM 35 S启动子和Nos polyA终止子,插入到中间表达载体pCAMBIA1300相应的多克隆位点中,经过酶切及PCR鉴定,获得了重组质粒,并通过冻融法将其转化到根癌农杆菌LBA4404中,成功地构建了AtNHX I基因的植物表达载体。采用苜蓿品种农宝的器官发生及胚状体发生两种再生体系进行农杆菌介导的AtNHX I基因的转化,并对其转化体系进行优化,最终得到了具有潮霉素抗性的转基因愈伤组织系。PCR及RT-PCR检测结果表明:潮霉素磷酸转移酶基因及AtNHX I基因已成功地整合到苜蓿基因组中,并在RNA水平上进行了转录。对转基因愈伤组织系的NaCl胁迫试验结果表明:在不同的盐浓度下,转基因愈伤组织的生长状态及愈伤组织的相对生长率均明显优于未转化的对照组愈伤组织,这初步证明AtNHX I基因的导入对苜蓿愈伤组织的耐盐性有所提高。