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在哺乳动物卵泡发育过程中,颗粒细胞对卵母细胞起到保护并提供营养的作用,而卵母细胞并非一个被动的接受者,卵母细胞自身合成一些因子,以旁分泌的形式作用于周围的颗粒细胞,调控颗粒细胞的生理状态。卵母细胞和颗粒细胞这种双向的物质信号交流过程,促使卵泡正常有序的发育。在卵母细胞来源的因子中,TGFβ家族是非常重要的一类。骨形态发生蛋白15（Bonemorphogenetic protein 15,BMP15）和生长分化因子9（Growthdifferentiation factor9,GDF9）是由卵母细胞分泌的两个生长因子,属TGFβ超家族成员。BMP15和GDF9能与卵丘细胞上的受体结合,引起下游基因的级联反应,影响卵丘细胞的增殖和凋亡,从而调节卵泡发育与卵母细胞成熟。BMPR2是卵丘细胞上表达的TGFβⅡ型受体,BMP15和GDF9分别通过不同的Ⅰ型受体与BMPR2结合,进而调控下游代谢反应。本课题组前期研究结果已经证明,牛卵丘细胞体外培养时,添加适当浓度的BMP15和GDF9,能够促进BMPR2的表达并调控细胞增殖和凋亡,然而,二者是如何影响BMPR2的机制尚不十分明确。为了进一步探索BMP15和GDF9通过BMPR2介导对牛卵丘细胞调控的作用机制,本文进行了如下的工作研究。首先,我们利用高通量测序技术构建了BMP15和GDF9处理的卵丘细胞与对照组的mRNA差异表达谱。结果显示,单独添加BMP15有246个基因上调,183个基因下调;单独添加GDF9有218个基因上调,150个基因下调;共同添加BMP15和GDF9有228个基因上调,202个基因下调。我们对这些基因进行了统计和生物信息学分析,筛选出可能与两种细胞因子调控卵丘细胞增殖及凋亡协同效应有关的4个基因:USP42、YWHAH、SMAD6和NOG,作为后续研究的基因。接下来对筛选出的基因分别进行siRNA敲降,检测BMPR2表达变化和细胞凋亡、增殖情况。结果显示,BMP15和GDF9添加能够抑制卵丘细胞凋亡。敲降USP42和YWHAH后,BMPR2上调,细胞凋亡无显著变化,CCND2、PCNA和CDC42显著上调;敲降SMAD6和NOG后,BMPR2显著下调,细胞凋亡增加,p53显著上调,bcl-2显著下调。这些结果说明,BMP15和GDF9分别通过USP42、YWHAH、SMAD6和NOG的介导,来调控下游基因,从而调节细胞的增殖和凋亡。为了初步探索BMP15和GDF9对卵丘细胞的调控作用与非编码RNA的关系,我们对4组处理进行了circRNA差异表达谱的测序。测序得到了1706个circRNA。对这些circRNA进行了生物信息学分析并筛选出差异circRNA。通过对来源基因的功能注释和富集分析,我们发现差异circRNA与运动,生殖,生物粘附,生长,激素分泌等有关。差异基因结果显示,添加BMP15有3个circRNA上调,6个circRNA下调;添加GDF9组中12个上调,24个下调;共同添加BMP15和GDF9时,15个circRNA上调,13个下调。circ15/a75、circENSBTAG000000126911和circn/a303在BMP15和GDF9组以联合添加组合组中都有差异。推测它们可能与BMP15和GDF9的加性效应有关。定量PCR分析表明,这三个circRNA的表达水平与测序结果一致。我们预测了这3个circRNA的靶miRNA,通过荧光定量PCR验证,靶miRNA的表达恰好与circRNA趋势相反。这些结果说明,BMP15和GDF9可能通过circRNA作为miRNA海绵调节miRNA的表达,从而影响下游靶基因,来调控卵丘细胞的状态并影响卵泡的发育。为了进一步探讨circRNA在BMP15/GDF9对卵丘细胞调控中的作用,本研究筛选了特异靶作用于BMPR2的miRNA,通过双荧光素酶报告确定BMPR2为miR-187的靶基因;btacircRNA11396是特异结合miR-187的circRNA,用siRNA抑制btacircRNA11396后,检测miR-187和靶基因BMPR2的表达量,结果显示,敲降btacircRNA11396能够使miR-187表达上调,BMPR2表达下调,细胞凋亡增加。因此,btacircRNA11396可能作为miRNA海绵,通过抑制miR-187的活性,促进BMPR2表达,抑制细胞凋亡。综上,研究结果为进一步揭示BMP15和GDF9对牛卵丘细胞的作用机制提供分子依据,为深入研究卵泡的发育提供了一定的理论基础。