【摘 要】
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乳腺癌是女性最大的杀手之一,其具有易发性和高转移性。在乳腺癌的发生发展过程中,首先要通过浸润性生长侵袭周围的正常组织,这个过程不仅涉及到单细胞迁移,还存在许多细胞以群体为单位按照相同的速度向同样的方向进行定向运动的群体迁移。肿瘤细胞迁移受到许多信号通路的调控,研究发现FAK-Rho-ROCK信号轴在各种恶性肿瘤中明显上调。在肿瘤细胞单细胞迁移中,高活性的FAK会抑制肿瘤细胞的失巢凋亡,并调节细胞与
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乳腺癌是女性最大的杀手之一,其具有易发性和高转移性。在乳腺癌的发生发展过程中,首先要通过浸润性生长侵袭周围的正常组织,这个过程不仅涉及到单细胞迁移,还存在许多细胞以群体为单位按照相同的速度向同样的方向进行定向运动的群体迁移。肿瘤细胞迁移受到许多信号通路的调控,研究发现FAK-Rho-ROCK信号轴在各种恶性肿瘤中明显上调。在肿瘤细胞单细胞迁移中,高活性的FAK会抑制肿瘤细胞的失巢凋亡,并调节细胞与ECM的黏附,而且Rho-ROCK通路的激活会增强细胞收缩力使得细胞可以以更高的速度进行迁移。研究发现,在群体细胞迁移中抑制肌球蛋白的活性,降低细胞收缩力,不仅不会抑制群体细胞迁移,还会使细胞的群体迁移能力增强,但其具体机制仍不清楚。因此本课题主要探讨肌球蛋白产生的收缩力是如何影响肿瘤细胞的群体迁移,以及FAK-Rho-ROCK信号轴如何对胞内收缩力的变化做出响应进而调控肿瘤细胞群体迁移。本课题选择具有群体迁移特性的乳腺癌MCF-7细胞作为研究对象,利用慢病毒转染手段构建三种具有不同肌球蛋白活性的细胞株。通过Western Blot实验验证稳定转染细胞株已经成功构建,并使用其进行实验。通过延时摄影研究伤口愈合过程发现肌球蛋白活性的增加抑制了肿瘤细胞的群体迁移,而失活的肌球蛋白则造成了相反的结果。为了阐明造成这种现象的原因,我们分别对影响细胞群体迁移的三个因素:细胞极性、细胞收缩力和黏附力进行了探究。结果发现虽然活化的肌球蛋白增加了细胞收缩力,但是影响了力在细胞群体内的极性分布。群体细胞迁移的方向性减弱,失去定向极化,并且细胞与基质的黏附力大大增加,这三个因素的共同作用导致群体迁移的速度下降。FAK作为一种酪氨酸激酶不仅可以调节细胞黏附,还可以通过Rho-ROCK通路调节细胞收缩力的大小,并且FAK自身作为机械敏感分子,还会对细胞内外的机械力学信号做出响应。因此我们进一步探究了肌球蛋白活性的改变如何影响FAK-Rho-ROCK信号轴。我们通过免疫荧光和Western Blot实验证明了高细胞收缩力会导致FAK的活化,即FAK在Y397位点的磷酸化程度增强。通过光遗传实验抑制细胞内的肌球蛋白活性发现细胞FAK活性降低,说明FAK活性的降低是由于收缩力降低导致的。接下来通过细胞荧光共振能量转移实验证明,高收缩力会使FAK的分子构象发生改变,导致FAK在Y397位点处发生磷酸化而被激活。免疫荧光实验和Western Blot实验发现,FAK的活化会使下游Rho-ROCK信号通路激活,并使用了光遗传实验和抑制剂进行验证。最后我们在高肌球蛋白活性的细胞群体中加入pFAKY397抑制剂后进行细胞划痕实验,结果发现其迁移能力得到恢复。综上所述,我们发现活化的肌球蛋白通过高细胞收缩力改变FAK的分子结构从而导致FAK的活化进而激活Rho-ROCK通路,使胞内收缩力得到进一步加强,形成正反馈循环。本研究阐明了肌球蛋白不仅位于FAK-Rho-ROCK信号轴的终点,还可以通过机械力学信号影响其上游信号通路,为探明乳腺癌细胞群体迁移机制提供了新的研究方向。
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