低氧是组织在正常氧含量的基础上生理性或人为性地减少现象,经常发生在急性或慢性血管疾病,肺病和肿瘤组织中。其中,低氧是肿瘤发生,侵袭和转移必经的过程之一,它促进了肿瘤致癌基因的表达,从而使得肿瘤细胞发生远处转移。低氧环境对于调节肿瘤的EMT(上皮细胞-间充质转化)过程具有重要作用,刺激肿瘤的恶化和转移,低氧也可促进血管生成因子的表达从而加快了肿瘤血管的形成。低氧诱导因子(HIFs)是迄今发现的组织细胞在低氧下诱生的最直接最重要的调控因子,其通过调节下游靶基因的表达协助氧的运送和对低氧的适应。HIFs属于PAS-bHLH转录因子家族成员,其由α和β亚基构成异二聚体,其中HIF-1α和HIF-2α是低氧诱导因子家族中功能研究的较为深入的两个成员。多种肿瘤组织中HIF的激活提示了低氧诱导因子在肿瘤组织细胞中极有可能诱导了下游相关基因的表达,其中,有一些与细胞增殖相关的成员。在正常细胞中,细胞增殖主要受到由细胞周期蛋白(Cyclins)、细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶(CDKs)以及细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶抑制因子(CKIs)组成的细胞周期调控系统的精细调控。其中,CCNE2(Cyclin E2)是细胞周期蛋白CyclinE家族成员之一,与CCNE1(CyclinE1)高度同源,是调控细胞周期的关键因子,主要负责细胞周期的G1/S转换过程的调控。在细胞中,Cyclin E家族的成员主要通过与CDK2相互作用形成Cyclin E-CDK2蛋白复合物,该复合物可以调控很多下游基因的磷酸化修饰,其中包括了很多与细胞增殖密切相关的蛋白因子。很多报道显示,乳腺癌细胞中CCNE2的表达失调,提示CCNE2的过表达与乳腺癌的发生、发展高度关联。这一现象在多种肿瘤细胞中都有发现,如结肠癌,胃癌,肺癌等。因此,Cyclin E,包括CCNE1和CCNE2,与肿瘤发生的相关机制研究已成为肿瘤学及肿瘤的靶向治疗研究的热点。目的本研究旨在揭示CCNE2是一个新的低氧靶基因,同时阐明其在乳腺癌细胞中的高表达可能与低氧诱导因子的调控相关,提示低氧可能通过促进了 CCNE2的表达诱导细胞的EMT。方法首先,我们利用生物信息学方法预测CCNE2启动子区域潜在的转录因子结合位点,然后采用双荧光素酶报告系统检测低氧对CCNE2启动子活性的影响;同时,我们以实时荧光定量PCR法(RT-qPCR)和免疫印迹(Western Blotting)技术检测低氧刺激后,MCF-7细胞本底CCNE2mRNA和蛋白表达的变化;利用RNA干扰技术,我们设计针对HIF-1α和HIF-2α的siRNA干扰片段以检测MCF-7细胞HIF-1α或HIF-2α干扰后,CCNE2mRNA及蛋白水平的变化,最后,通过慢病毒过表达CCNE2观察MCF7细胞的EMT表型。结果生物信息学分析发现,CCNE2启动子区域上游的1214bp至下游的627bp中含有多个可能与低氧相关转录因子结合的位点,即多个低氧应答元件(HRE);实验发现,低氧刺激24h可显著上调CCNE2启动子的活性;不仅如此,我们还发现,MCF-7细胞在低氧处理后,其本底CCNE2 mRNA和蛋白水平均显著上调;RNA干扰实验结果显示,MCF-7细胞中HIF-2α而不是HIF-1α的干扰后,低氧不能有效地诱导CCNE2的表达。最后,发现过表达CCNE2,MCF7细胞出现EMT表型。结论CCNE2可能作为低氧的新的靶基因,其在乳腺癌中能可能通过低氧诱导因子HIF-2α对低氧微环境的应答而特异性地上调其表达,从而促进肿瘤的侵袭和转移。