研究背景和目的动脉粥样硬化(Atherosclerosis, AS)是一种慢性、进行性的、炎性相关的动脉疾病,主要累及大、中弹力动脉,它是以脂质沉积、炎性细胞浸润、平滑肌细胞迁移、细胞外基质降解为主要特征的。其致病机理目前尚不明确,多项实验证据表明,冠状动脉粥样硬化是以血管内皮细胞功能障碍为始发事件,进展到由一系列的炎性细胞因子(IL-1β, TNF-α, MCP-1, IL-8, ICAM-1, VCAM-1等),基质蛋白酶(MMPs, Tryptase/Chymase, Serine proteinases plasminogen activator and plasminogen, Cathepsins, ADAMTSs等)参与,并伴有平滑肌细胞增生的慢性血管炎症。急性冠脉综合征(Acute coronary syndrome, ACS)是冠状动脉粥样硬化转归的终末期表现。多项研究表明,冠状动脉粥样硬化斑块破裂,继发血栓形成,导致冠状动脉管腔急剧缩窄或者完全闭塞,这是不稳定型心绞痛,急性心肌梗死以及心源性猝死的主要病理生理机制。动脉粥样硬化斑块病灶内的巨噬细胞成分决定着动脉粥样硬化的进程,决定粥样斑块的稳定性,并与血栓并发症密切相关。四个紧密连接但又相互独立的过程控制着粥样硬化斑块内的巨噬细胞成分的变化,分别是：化学趋化,粘附,迁移和分化,凋亡(泡沫细胞)。国内外大量资料表明,化学趋化因子(MCP-1,IL-8等)以及粘附分子(ICAM-1, VCAM-1等)在内皮细胞或者其他动脉粥样硬化相关细胞的表达上调,对于粥样硬化的进展以及斑块的去稳定性都有着较为深远的影响。基质蛋白酶参与了动脉粥样硬化发生、发展的全过程。大量的实验证据表明细胞外基质蛋白酶,如金属基质蛋白酶类(MMPs)、组织蛋白酶类(Cathepsin K,S,L)、丝氨酸蛋白酶纤溶酶原激活物和纤溶酶原(Serine proteinase plasminogen activator and plasminogen)等在动脉粥样硬化平滑的增生迁移以及不稳定斑块纤维帽基质细胞外成分的降解过程中都扮演着重要角色,它们的作用已毋庸质疑。近年来,新型的金属基质蛋白酶ADAMTS家族又一次吸引了人们的注意力。ADAMTS蛋白酶是一类分泌型金属蛋白酶,有着广泛的作用底物。先前的实验表明,ADAMTS4可能通过降解动脉粥样硬化斑块纤维帽内的Versican成分诱使斑块破裂,并可作为斑块不稳定的临床标记物。但ADAMTS4在动脉粥样硬化过程中的具体作用及其潜在的分子调控机制目前尚不明确。他汀类药物(HMG-CoA还原酶抑制剂,Statins)目前已被广泛的应用于降低升高的脂质水平和心血管危险度。近年来大量证据表明,除去为大家所熟知的明确的降低胆固醇的作用之外,他汀类药物至少还可以通过调节炎症反应、改善内皮功能,下调粘附分子和化学趋化因表达,对抗氧化应激等机制,使心血管病患者获益。他汀类药物独立于降低胆固醇的作用之外,在稳定和逆转动脉硬化斑块方面的多效性,使得它在冠心病的短期治疗(不稳定心绞痛,急性心肌梗死)以及长期治疗(慢性稳定性冠心病)治疗当中均占有一席之地。我们相信,随着研究的不断深入,他汀类药物在抗动脉粥样硬化方面将会有更多的作用被发现,更多的效应通路会被阐明。不稳定型心绞痛(Unstable angina pectoris, UAP)是动脉粥样硬化斑块失稳定性最常见的临床表现类型。据统计,不稳定心绞痛患者一年内发生急性心肌梗死的概率达12-13%,死亡率更高达3-18%。因此,加强对不稳定心绞痛患者监控和治疗,对预防急性心肌梗死发生,降低死亡率有着重要意义。所以,寻找一种安全、简单,方便,无创,有效的监控手段或者生物学指标对心血管医生来说是目前的首要任务。S100A4属于钙结合蛋白S100家族,最先发现于小鼠肾上腺癌细胞中,后证实,S100A4在多种肿瘤组织中高表达,并与肿瘤的淋巴结转移、血管浸润、恶性程度、TMN分期等密切相关,并可作为评价肿瘤预后的独立预测因子。S100A4可在几乎所有的细胞类型中表达,在发挥细胞内功能的同时,又可以共价结合二聚体的形式分泌的细胞外,发挥细胞外功能。除与恶性肿瘤相关外,现有的动物和临床资料表明,S100A4还可能参与了一系列炎性相关疾病的病理生理过程,如类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis, RA),牛皮癣(Psoriasis),炎性肠病(Inflammatory bowel disease, IBS),特发性炎性肌病(Idiopathic inflammatory myopathy, IIM)等。最近,研究者在同样为炎性失调的动脉粥样硬化斑块以及冠脉血运重建术后再狭窄的病灶中发现了高表达的S100A4。一项最新的研究结果显示,在冠状动脉不稳定斑块中S100A4表达也明显上调,这提示S100A4可能也与斑块的去稳定性有关。鉴于炎症与动脉粥样硬化和斑块去稳定性的密切关系,我们提出了一个很诱人的假设：S100A4参与了冠状动脉粥样硬化发生、发展的过程,并可能代表一种新的斑块去稳定性的机制,促使斑块破裂,诱发急性心脏事件。为了验证这个的假设,我们采用了临床和实验相结合的实验方法,并着重观察其对血管内皮细胞中化学趋化因子(MCP-1, IL-8)和粘附分子(ICAM-1, VCAM-1)以及单核/巨噬细胞中新型金属基质蛋白酶ADAMTS4和MMP-9的调控作用。同时,我们以活体和体外研究相结合的方式研究了他汀类药物对于S100A4释放的调控作用。最后,我们评价了外周血S100A4水平对于UAP患者短期主要心血管事件的预测价值。方法1.冠状动脉粥样硬化性心脏病患者外周血S100A4水平检测选取因怀疑为CAD而入院行择期CAG手术的患者78人。所有患者术前股动脉取血,ELISA方法分别检测外周血S100A4,hs-CRP和ADAMTS4浓度水平。根据CAG结果,将病人分为造影CAD组和对照组,分别比较两组患者外周血S100A4,hs-CRP和ADAMTS4浓度水平,并利用二元多因素logistic回归分析寻找与造影CAD独立相关的因素。另外,我们还入选了经CAG证实的CAD患者91例,其中UAP59例,SAP32例。健康对照组为30例年龄和性别相匹配的健康成年人,所有患者均于入院后即刻肘静脉无菌取血,ELISA方法分别检测外周血S100A4和hs-CRP浓度水平。ROC曲线用于分析和比较S100A4和hs-CRP水平诊断UAP的效能。以患者CAG结果为基础,根据病人的临床症状和心电图所见确定罪犯血管,并按照Ambrose’s分类法将脉罪犯血管病变的斑块分为简单病变和复杂病变,分别比较罪犯病变斑块形态为简单病变和复杂病变的SAP和UAP患者的外周血S100A4水平,并利用二元多因素logistic回归分析寻找与CAG复杂病变独立相关的因素。2.动脉粥样硬化斑块中S100A4的表达和释放连续随机入选入院行颈总动脉内膜切除术的病人10例,根据病人在手术之前的6个月内是否发生过同侧中风、短暂性脑缺血发作以及短暂性黑蒙等脑血管症状将他们分为有症状颈总动脉斑块组合无症状行颈总动脉斑块组。通过颈总动脉内膜切除术获得的斑块组织速冻于液氮中,Trizol提取总RNA,半定量RT-PCR扩增S100A4与CD68基因,以管家基因GADPH作为内参照。另外,入选以稳定心绞痛入院行PCI手术患者6例,分别于PCI手术之前,手术后2小时、4小时、8小时以及24小时取血。ELISA方法测定血样S100A4水平变化。3.S100A4的炎性调控将THP-1细胞以5×105个/ml密度接种于24孔板中,暴露于终浓度为160nmol/ml的PMA中,72小时后换液。RT-PCR以及Western-blot方法检测THP-1细胞分化前后S100A4mRNA以及蛋白表达水平的变化。同时,向分离自UAP (n=9), SAP (n=9)以及健康成年人(n=9)的外周血单个核细胞(PBMCs)中分别加入oxLDL (20ng/ml)或者IL-1β(10ng/ml),孵育24小时后,取无细胞上清,ELISA法测定S100A4浓度。另外,分别应用oxLDL (20ng/ml)或者IL-1β(10ng/ml)单独或者共同刺激THP-1巨噬细胞以及HUEVCs,24小时后取细胞上清液,ELISA法测定S100A4浓度。4.S100A4的生物学效应分别以不同的rhS100A4浓度(空白,100ng/ml,500ng/ml,1000ng/ml和2000ng/ml)刺激THP-1巨噬细胞6小时和18小时,取细胞上清。在另外单独的实验中,THP-1巨噬细胞以PTDC(终浓度10umol/l)预处理30分钟,然后再加入终浓度为1000ng/ml的rhS100A4刺激24小时,取细胞上清。分别以ELISA法检测各组细胞上清液中MMP-9和ADAMTS4浓度。分别以不同的rhS100A4浓度(空白,100ng/ml,500ng/ml,1000ng/ml和2000ng/ml)刺激HUEVCs6小时和24小时,戊二醛固定内皮细胞,细胞ELISA法检测内皮细胞表面ICAM-1和VCAM-1的表达(6小时),ELISA法检测细胞培养上清液中MCP-1和IL-8浓度(24小时)。在Transwell实验中,上室中加入密度为2×105个/ml的THP-1单核细胞,下室中分别加入浓度递增的rhS100A4(空白,100ng/ml,500ng/ml,1000ng/ml和2000ng/m1),细胞培养箱内37℃,5%CO2孵育30分钟,取出小室,弃去上室培养基,4%多聚甲醛固定,苏木素染色后,光学显微镜下随机选取5个高倍镜视野计数。另外,在单独的实验中,个别实验组在下室中预先加入S100A4中和抗体(终浓度20ug/m1),然后再加入终浓度为1000ng/ml的rhS100A4,细胞培养箱内37℃,5%CO2孵育30分钟,按照上述步骤染色计数。5.他汀类药物对于S100A4水平的影响选取经CAG证实为冠心病,但之前没有接受过他汀类药物治疗的病人36例,其中UAP20例,SAP16例,所有患者签订知情同意书后开始阿托伐他汀(20mg/d)治疗,分别于治疗开始前和治疗开始后1个月时空腹肘静脉取血,检测血脂以及S100A4水平。在体外实验中,为了尽可能准确的模拟动脉粥样硬化条件下的真实的病理生理情况,HUEVCs和THP-1巨噬细胞分别用oxLDL (20ng/ml)刺激24小时,更换无血清培养基,然后再次加入终浓度为20ng/ml的IL-1β(10ng/ml)刺激24小时,其中他汀组在加入IL-1β之前,预先加入终浓度为10μmo1/1的邻羟基阿托伐他汀孵育2小时。ELISA法测定上清中S100A4含量。在另外单独的试验中,HUEVCs和THP-1巨噬细胞分别加入邻羟基阿托伐他汀(10μmol/1)预处理2小时,然后再加入IL-Iμ(10ng/m1)刺激,分别于6小时和24小时收取细胞,Real-time PCR和Western-blot法比较S100A4在mRNA和蛋白水平的变化。6.外周血S100A4对于不稳定型心绞痛患者短期预后的预测价值连续随机入选不稳定心绞痛患者66人,进行为期6个月的随访,随访终点为：(1)心源性死亡(2)非致命性心肌梗死(3)再发需要入院治疗的不稳定心绞痛。鉴于该随访队列病人的数量,我们进一步根据随访病人的外周血S100A4水平的四分位间距将病人分为四组,比较四组6个月心血管事件发生的相对危险度。同时,应用二元多因素logistic回归分析确定与UAP患者随访期间主要心血管不良事件(MACE)的发生独立相关的因素。结果1.经CAG正常的患者相比较,经CAG证实的慢性稳定性心绞痛(chronic stable angina,CAS)患者血清S100A4浓度明显升高(436.5±151.0vs76.6±28.1,P<0.001)。与之相似的,造影CAD患者的外周血hs-CRP和ADAMTS4水平也均明显高于CAG正常的患者(hs-CRP：2.86±2.42vs1.40±0.80,P=0.005;ADAMTS4:72.25±15.64vs40.65±7.12,P<0.001).同时,Logistic回归分析结果显示,外周血S100A4和ADAMTS4水平分别于与造影CAD独立相关(S100A4:OR=1.020,95％CI=1.005-1.035,P=0.009;ADAMTS4: OR=1.137,95%CI=1.002-1.291,P=0.047).在另外的临床观察中,我们发现,与健康对照组相比较,UAP和SAP组,血清S100A4水平均明显升高,尤其以UAP最为明显(UAP:346.2±106.30ng/ml;SAP:565.0±128.1ng/ml;健康对照组99.0±44.7ng/m1,P<0.01).在UAP患者中,血清S100A4水平hs-CRP水平呈正相关(r=0.473,P=0.001)。ROC分析显示血清S100A4水平在诊断UAP方面就有较高的特异性和灵敏性。在UAP患者中,S100A4水平在复杂病变组显著高于简单病变组(445.01±99.06ng/ml vs596.30±117.94ng/ml,P<0.001),而在SAP患者中,S100A4水平在复杂病变组也趋向于升高,但无统计学差异。二元多因素logistic回归分析结果显示,无论在CAD患者还是在UAP患者中,S100A4水平均与复杂病变独立相关(CAD:OR=1.009,95%CI.1.001-1.017,P=0.031;UAP:OR=1.010,95%CI=1.001-1.019,P=0.028).2.与无症状组的颈总动脉斑块相比,S100A4mRNA表达水平在有症状组中显著升高(P=0.0047).Pearson相关性分析显示,在所有颈总动脉斑块中S100A4mRNA表达水平与CD68mRNA表达水平程正相关(r=0.66,P=0.038)。在接受PCI治疗的SAP患者中,血清S100A4的水平在PCI术后逐渐升高,在术后第2小时达峰,后缓慢下降,至术后24小时恢复至术前水平。3.THP-1细胞分化成为巨噬细胞后,S100A4mRNA以及蛋白的表达水平明显上调(P<0.001,P<0.05).在PBMCs中,oxLDL和IL-1β能够较为明显的诱导S100A4的释放,这种作用在分离自UAP病人的PMBCs中最为明显。在THP-1巨噬细胞中,IL-1β和oxLDL也能够显著的诱导S100A4的释放(35.39±3.02ng/ml vs65.70±3.35ng/ml vs55.36±4.99ng/ml,P<0.001),并且二者具有叠加效应(91.24±6.42ng/ml,P=0.002)。然而,在HUEVCs中,IL-1β和oxLDL单独刺激对于细胞上清液中S100A4浓度影响不大(17.70±1.39ng/ml,19.75±1.12ng/ml,19.58±0.97ng/ml, P=0.137),但当二者共同刺激HUEVCs后,S100A4的浓度显著升高近2倍(36.15±3.77ng/ml,P<0.001)。4.在THP-1巨噬细胞中,随着rhS100A4刺激浓度的逐渐升高,细胞上清中MMP-9的浓度水平也逐渐升高,并且这种效应以刺激18小时时最为显著。rhS100A4诱导的THP-1巨噬细胞上清中ADAMTS4的释放也表现为类似的趋势。NF-KB抑制剂PTDC (10umol/l)能够有效的抑制甚至完全消除rhS100A4诱导的THP-1巨噬细胞上清中MMP-9和ADAMTS4的分泌(P值均小于0.05)。rhS100A4能够浓度依赖性的诱导HUEVCs表面ICAM-1的表达。rhS100A4对于VCAM-1的调控也具有类似的趋势,应用不同浓度的rhS100A4刺激HUEVCs,细胞上清中MCP-1的浓度水平随着rhS100A4浓度的升高而升高。同样的,HUEVCs中IL-8的分泌也具有rhS100A4浓度的依赖性。Tran swell实验的结果表明,不同浓度的(从100ng/ml-2000ng/ml)rhS100A4蛋白对THP-1单核细胞均具有显著的化学趋化活性(P值均小于0.05)。向Transwell下室中加入S100A4中和抗体(终浓度20ug/m1)则能够完全阻断rhS100A4(1000ng/ml)诱导的THP-1细胞趋化(P<0.05)。5.经过1个月的他汀治疗,冠心病患者外周血S100A4水平明显降低(他汀治疗前：482.98±153.63ng/ml；他汀治疗后：396.18±125.87ng/ml,P=0.011),Pearson相关分析显示他汀的这种作用是独立于他汀的调脂作用之外的(r=-0.087,P=0.613)。体外实验结果显示,邻羟基阿托伐他汀(10umol/1)能够显著地降低IL-1β(10ng/m1)诱导的THP-1巨噬细胞中S100A4的释放(IL-Iβ刺激组：321.17±29.28ng/ml vs IL-Iβ他汀组：190.35±9.44ng/ml,P=0.02),然而,邻羟基阿托伐他汀对于S100A4的基础释放水平没有影响(他汀组：118.86±13.50ng/mlvs空白对照组：113.92±8.46ng/ml,P=0.621)。在人脐静脉内皮细胞(HUEVCs)中也观察到了类似的结果。另外,邻羟基阿托伐他汀并不能影响IL-Iβ诱导的THP-1巨噬细胞和HUEVCs中S100A4mRNA的表达水平,但却能够使细胞内S100A4蛋白的表达显著上调(P<0.05)。6.至随访结束时,共有21例终点事件发生：心源性死亡2例,非致命性心肌梗死3例,再发不稳定心绞痛16例。与没有发生终点事件的患者相比,发生终点事件的患者在入院时有着较高的外周血S100A4水平(656.9.5±97.8ng/ml vs522.3±124.9ng/ml, P=0.001)。同时,患者6个月心发生血管事件的相对危险对随着S100A4水平的升高而升高,并有统计学意义(P=0.008)。二元多因素logistic回归分析结果显示,在UAP患者中,外周血S100A4水平和治疗方式与随访6个月MACE独立相关(OR=1.010,95%CI:1.003-1.020,P=0.007).结论1.S100A4在动脉粥样硬化斑块内局部上调并受炎性调控,并可能至少部分通过诱导血管内皮细胞化学趋化因子(MCP-1、IL-8)和粘附分子(ICAM-1、 VCAM-1)的分泌和表达,加强单核细胞的化学趋化以及调控单核/巨噬细胞基质蛋白酶(MMP-9、ADAMTS4)的分泌等机制,活化血管内皮细胞和单核/巨噬细胞,增强炎症反应和细胞外基质的降解,参与了动脉粥样硬化和斑块的去稳定性过程。2.他汀类药物(阿托伐他汀)独立于其调脂作用之外,能够降低冠心病患者外周血的S100A4水平,并能够在细胞水平抑制致炎因子S100A4的释放(分泌)。而后者可能是前者的细胞学基础。3.S100A4可以作为一个预测不稳定型心绞痛患者短期预后的生物学指标。4.S100A4可以作为一个冠心病治疗的新的靶点。