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研究背景和目的心肺复苏（cardiopulmonary resuscitation,CPR）后自主循环恢复（restoration of spontaneous circulation,ROSC）的同时会引起全心缺血再灌注损伤（whole myocardial ischemia/reperfusion injury,WMI/RI）,进而导致复苏后心功能障碍（post resuscitation myocardial dysfunction,PRMD）,影响心脏骤停（cardiac arrest,CA）患者的救治成功率和远期生存质量。有关CPR后WMI/RI病理生理机制的研究及改善心功能药物的研发一直是该领域研究的热点,其中针对氧化应激的干预和清除自由基的治疗方案均呈现出积极的保护效应,可减轻WMI/RI所致的心功能障碍。凋亡（apoptosis）及坏死性凋亡（necroptosis）均为与WMI/RI密切相关的细胞程序性死亡方式。研究显示,抗氧化治疗可抑制细胞凋亡及坏死性凋亡,减轻心肌损伤。本课题组前期研究发现广西容县沙田柚外层果皮挥发油（pomelo peel essential oil,PPEO）可减轻CPR后脑缺血再灌注损伤,提示PPEO清除自由基及抗氧化的活性具有潜在的临床应用价值,但其对CPR后心肌损伤的影响尚不明确。因此,本研究采用蒸馏法提取PPEO,并鉴定其主要成分;采用食道电刺激致室颤方法建立CA/CPR大鼠模型,探讨CPR后MI/RI的特点及PPEO能否通过抑制心肌细胞凋亡和坏死性凋亡减轻CPR后大鼠心肌损伤,为CPR后心脏保护提供新的思路。方法本研究分两部分进行:第一部分,观察CPR后不同的时间点大鼠心肌损伤的特点以及探讨PPEO拮抗心肌损伤的作用;第二部分,探讨PPEO拮抗CPR后大鼠心肌死亡的作用。1第一部分柚子皮挥发油拮抗心肺复苏后大鼠心肌损伤的作用1.1观察CPR后不同时间点心肌损伤特点采用经食道电刺激致室颤方法构建Spragu-Dawley（SD）大鼠CA/CPR模型,CA时间为7分钟,经CPR术后,将ROSC大鼠按随机数字表法分为3组,分别是ROSC后12小时组（12h组,n=10）、ROSC后24小时组（24h组,n=10）,ROSC后48小时组（48h组,n=10）,另设置假手术组（Sham组,n=10）作为对照,假手术组大鼠行麻醉、动静脉置管及经口气管插管等操作,但不施行电刺激诱导CA及CPR操作。各组大鼠按照分组时间点行动物心脏超声检查后取心脏标本和血液样本,通过苏木素-伊红（hematoxylin-eosin stain,HE）染色和血清肌钙蛋白T（c Tn T）评估各组心肌损伤程度,通过心脏超声检测各组大鼠左心室舒张末期内径（LVDd）、左心室收缩末期内径（LVDs）、左心室短轴缩短率（LVFS）及左心射血分数（LVEF）以评估不同时间点心脏功能变化。1.2探讨PPEO拮抗CPR后大鼠心肌损伤的作用采用蒸馏法提取PPEO,并应用气相色谱-质谱联用技术鉴定PPEO主要成分。采用经食道电刺激致室颤方法构建CA/CPR大鼠模型,CA时间为7分钟,经CPR术后,将ROSC大鼠按随机数字表法分为4组,分别是模型组（CA组,n=10）、甘油组（GLY组,n=10）、低剂量PPEO组（低剂量组,n=10）和高剂量PPEO组（高剂量组,n=10）;另设置假手术组（Sham组,n=10）作为对照,此组大鼠行麻醉、动静脉置管及经口气管插管等操作,但不施行电刺激诱导CA及CPR操作。ROSC后半小时,单次经股静脉注射相应药物,低剂量组为20mg/kg PPEO,高剂量组为40 mg/kg PPEO,CA组为等体积生理盐水,GLY组为等体积10%甘油。各组ROSC后24小时分别行超声心动图检查,然后采集动脉血和心脏标本。通过检测各组血清肌钙蛋白T和乳酸水平评估心肌损伤程度,通过HE染色观察各组大鼠心肌细胞形态学改变,通过检测大鼠LVDd、LVDs、LVFS及LVEF观察各组大鼠心脏功能的差异,2第二部分柚子皮挥发油拮抗心肺复苏后大鼠心肌死亡的作用探讨PPEO拮抗CPR后大鼠心肌死亡的作用。动物模型的构建和分组与第一部分1.2相同,各组自主循环恢复后24小时分别取心脏组织。通过TUNEL染色和蛋白免疫印迹实验检测凋亡相关蛋白（Cleaved-caspase3、BCL-2及BAX）评估各组大鼠心肌细胞凋亡水平;通过免疫组织化学染色和蛋白免疫印迹实验检测坏死性凋亡相关的关键蛋白（TNF-α和p-MLKL）以评估各组大鼠心肌细胞坏死性凋亡水平。结果1第一部分1.1 CPR后不同时间点心肌组织形态学变化与Sham组相比,12h组、24h组及48h组HE染色均显示不同程度心肌细胞病理损伤;与12h组和48h组相比,24h组心肌损伤程度较重。1.2 CPR后不同时间点c Tn T变化与Sham组相比,12h组、24h组及48h组c Tn T水平均升高（p＜0.05）;与12h组相比,24h组及48h组c Tn T水平均升高（p＜0.05）;与24h相比,48h组c Tn T水平明显下降（p＜0.05）。1.3 CPR后不同时间点心脏功能变化与Sham组相比,12h组、24h组、48h组LVEF及LVFS均下降（p＜0.05）,LVDd及LVDs均升高（p＜0.05）;与12h组相比,24h组及48h组LVEF及LVFS明显下降（p＜0.05）,LVDd及LVDs明显升高（p＜0.05）;与24h相比,48h组LVEF及LVFS明显升高（p＜0.05）,LVDd及LVDs明显下降（p＜0.05）。1.4 PPEO气相色谱-质谱分析结果PPEO分析后共鉴定其中17种化合物,占PPEO总量的98.89%。主要成分柠檬烯,占PPEO总含量88.68%;诺卡酮（黄酮类物质）占PPEO总含量5.73%;月桂烯,占PPEO总含量1.02%;其它成分包括石竹烯、香芹酮等。1.5 PPEO减轻CPR后心肌组织形态学损伤与Sham组相比,CA组及GLY组呈现严重的心肌病理损伤;与CA组相比,低剂量PPEO组心肌损伤破坏程度轻度减轻,高剂量PPEO组心肌损伤明显减轻。1.6 PPEO降低CPR后心肌损伤标志物水平与Sham组相比,CA组和GLY组血清乳酸和c Tn T水平显著升高（p＜0.05）;与CA组相比,低剂量和高剂量PPEO组血清乳酸和c Tn T水平降低（p＜0.05）;与低剂量PPEO组相比,高剂量组乳酸和c Tn T水平明显降低（p＜0.05）。1.7 PPEO减轻CPR后心功能障碍与Sham组相比,CA组及GLY组LVEF及LVFS均下降（p＜0.05）,LVDd及LVDs均升高（p＜0.05）;与CA组相比,低剂量及高剂量PPEO组LVEF及LVFS明显升高（p＜0.05）,LVDd及LVDs明显下降（p＜0.05）;与低剂量PPEO组相比,高剂量组LVEF及LVFS明显升高（p＜0.05）,LVDd及LVDs明显下降（p＜0.05）。2第二部分2.1 PPEO拮抗CPR后大鼠心肌凋亡TUNEL染色:与Sham组相比,CA组及GLY组心肌细胞凋亡指数显著升高（p＜0.05）;与CA组相比,低剂量和高剂量PPEO组心肌细胞凋亡指数明显下降（p＜0.05）;与低剂量PPEO组相比,高剂量组凋亡指数明显下降（p＜0.05）。蛋白免疫印迹实验:与Sham组比较,CA组和GLY组Cleaved-caspase3及BAX的表达量明显增加（p＜0.05）,BCL-2的表达量明显下降（p＜0.05）;与CA组比较,低剂量和高剂量PPEO组心肌Cleaved-caspase3及BAX表达量下降（p＜0.05）,BCL-2的表达量明显增加（p＜0.05）;与低剂量PPEO组比较,高剂量组Cleaved-caspase3及BAX的表达量下降,BCL-2的表达量升高（p＜0.05）,呈剂量依赖性变化趋势。2.2 PPEO拮抗CPR后心肌坏死性凋亡坏死性凋亡的关键蛋白免疫组化染色和蛋白免疫印迹实验:与Sham组比较,CA和GLY组心肌组织中TNF-α及p-MLKL的阳性表达率和蛋白表达量均升高（p＜0.05）;与CA组比较,低剂量及高剂量PPEO组心肌组织中TNF-α及p-MLKL阳性表达率和蛋白表达量下降（p＜0.05）,且高剂量PPEO组心肌组织中TNF-α及p-MLKL阳性表达率和蛋白表达量较低剂量组更低（p＜0.05）。结论本研究证实PPEO可通过下调CPR后TNF-α及促凋亡蛋白（Cleaved-caspase3、Bax）表达,上调抗凋亡蛋白（Bcl-2）表达,同时也下调坏死性凋亡相关蛋白p-MLKL表达,进而抑制WMI/RI引起心肌细胞凋亡和坏死性凋亡,拮抗CPR后心肌损伤,具有CPR后心肌保护作用,为CPR后WMI/RI诊治提供新的思路与方向,也为进一步开发利用PPEO提供依据。