铜绿假单胞菌( Pseudomonas aeruginosa , PA) ,是一种常见的院内获得性感染条件致病菌,在自然界分布广泛,具有极强的环境适应能力,它常常引起创伤及免疫受损机体的严重感染,也是烧伤患者极易发生感染的菌种之一,病死率较高,预防和治疗铜绿假单胞菌感染已成为降低烧伤病人致残率和病死率的主要措施。由于其能形成生物膜,以及对大多数的抗生素具有耐药性使得其很难被彻底治疗。特别是近期已经出现了对亚胺培南和全部第三代头孢菌素及常用抗假单胞菌药物均耐药的多重耐药铜绿假单胞菌。针对铜绿假单胞菌耐药性日益增强,而抗生素疗效愈来愈下降的迫切现状,如何研发更有效的药物治疗铜绿假单胞菌感染,已成为抗感染治疗急待解决的问题。人防御素是机体抵抗病原微生物入侵的第一道天然防线,是人体内重要的天然免疫物质;人防御素含40～50个氨基酸,是分子质量为4～5 kDa的阳离子短肽,精氨酸含量相对丰富,为非糖基化蛋白。分子内含有6个保守的半胱氨酸残基,可形成3个典型的分子内二硫键,构成3个稳定的反向β片层结构;是一类具有广谱抗微生物活性的小分子抗菌肽,具有抗菌、抗病毒及杀伤肿瘤细胞的多种效应。人β防御素4 (human Beta defensin 4)是由Wolf-Georg Forssmann于2001年发现,属于β防御素,含有50个氨基酸,具有广谱抗菌活性,尤其对耐药性铜绿假单胞菌具有强大的杀菌作用。Yanagi研究表明在所有铜绿假单胞菌感染的病人中都可检测到hBD2和hBD4表达,体外活性实验结果也表明hBD2和hBD4对铜绿假单胞菌有很强的杀伤活性,HBD4的杀伤活性更高,这些结果都表明在铜绿假单胞菌感染的过程中,hBD2和hBD4在机体的感染防御中发挥着重要作用;针对hBD4对铜绿假单胞菌高杀伤活性,临床烧伤研究人员将hBD4基因导入皮肤细胞,使其能高表达hBD4以用来治疗预防铜绿假单胞菌对烧伤皮肤的感染;结果表明,与普通皮肤细胞相比,该基因工程细胞对铜绿假单胞菌有很强的抑制性。hBD4天然产量非常低,而化学合成成本相当高,通过基因工程技术生产防御素可满足科研和开发新药研究的需要,具有广阔的应用前景。由于抗菌肽对宿主的毒性,在E.coli系统中直接表达抗菌肽产量很低,且易受到宿主细胞蛋白酶的降解。融合表达或在酵母中表达是两种解决方法,大肠杆菌表达系统是目前最为成功的外源蛋白表达系统之一,已有好多阳离子肽在大肠杆菌中成功融合表达。鉴于以上的问题,我们选用了目前表达重组蛋白功能最强大的pET系统,并在目的蛋白N端融合谷胱甘肽巯基转移酶(GST)蛋白标签,在大肠杆菌中表达可溶性重组GST融合人β防御素4蛋白。为了获得天然N端的人β防御素4蛋白,我们在GST标签与人β防御素4蛋白之间添加了肠激酶(Enterokinase)酶切位点,以便融合蛋白纯化后,通过肠激酶酶切释放人β防御素4蛋白,最终获得与天然人β防御素4蛋白氨基酸序列相同的重组人β防御素4蛋白。并对重组人β防御素4蛋白的活性进行了研究,测定其体外抗菌活性,本课题研究的主要内容和结果如下:1.构建原核表达载体和优化表达目标蛋白:我们以人β防御素4基因为模版,通过PCR扩增人β防御素4基因,双酶切后与载体pET-42a(+)连接,构建了重组质粒,并经基因测序证实结果正确,表明原核表达载体构建成功,重组质粒命名为pET42-hBD4。本研究选用的pET原核表达系统是目前在大肠杆菌(E.coli)中克隆表达重组蛋白功能最强大的系统,蛋白表达由宿主菌提供的T7RNA聚合酶诱导,非诱导条件下则不存在基础转录,从而使克隆与表达很好的分离。本实验目的基因克隆到载体后,重组质粒首先选用不含有T7RNA聚合酶基因的宿主菌(DH5a)进行克隆,这就避免了对宿主细胞有毒的蛋白产物对质粒稳定性的影响;完成克隆后,将其转入染色体上带有lacUV5调控的T7RNA聚合酶基因的表达宿主菌BL21(DE3)中,用IPTG诱导表达,融合蛋白以可溶的形式表达。本实验需要大量的目的蛋白用于后续实验,因此,我们对表达条件也进行了优化,最佳表达条件为:37℃诱导4h, IPTG浓度为0.5 mmol/L。2.重组GST-hBD4融合蛋白的纯化:本研究选用了固定化金属离子亲和层析法(IMAC)纯化蛋白,它的优点是金属离子配基具有很好的稳定性,吸附量大,成本低,纯化时间短。实验结果表明,镍柱纯化后,GST-hBD4融合蛋白的纯度能达到90%以上。肠激酶酶切后,再用镍柱纯化hBD4蛋白,纯度约为95%,透析脱盐后,满足后续测活实验的要求。3.重组人β防御素4外抗菌活性的研究:通过琼脂扩散法初步测定了重组人β防御素4对铜绿假单胞菌(ATCC27853 )、金黄色葡萄球菌敏感株(ATCC 25923)、大肠埃希菌(ATCC35218)、粪肠球菌(ATCC29212)的抗菌活性,发现其对铜绿假单胞菌活性最强,与报导一致。我们采用微量稀释法测定了重组人β防御素4对铜绿假单胞菌的体外抗菌效力,结果证实,重组人β防御素4有较好的杀菌活性,其对铜绿假单胞菌的MIC和MBC都是小于哌拉西林和环丙沙星而略大于亚胺培南,提示其较前两种传统抗生素对铜绿假单胞菌在体外具有更好的杀菌活性。综上所述,我们成功构建了原核表达载体pET42-hBD4,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)后,经IPTG诱导,镍柱纯化获得了较高纯度的重组人β防御素4蛋白。重组人β防御素4蛋白有较好的抗菌活性。本实验的研究结果为人β防御素4后期在临床上进一步开发和应用治疗铜绿假单胞菌感染奠定了基础。