不定根是指从茎、叶和老根的非中柱鞘组织产生的根,是植物无性繁殖的重要途径之一。近年来,对不定根形成过程中信号转导的研究受到重视,并在生长素信号转导研究中取得了一些重要进展。但对于其信号转导的详细过程和分子机制仍然知之甚少,这方面研究的深入将会为植物信号转导和发育调控的研究开拓新的领域。一氧化氮(NO)是一种兼有水、脂溶性的小分子物质,其在动物体内的信号分子作用己为人们所熟知。植物NO信号的研究是目前热点,但其在植物不定根形成信号转导中的作用的研究不是特别深入,其相关机理研究并不多见。H2O2是生物细胞代谢过程中产生的一种活性氧(ROS),是动植物细胞响应各种应激反应所产生的重要的信号分子。关于H2O2介导植物不定根形成的信号转导过程的研究刚刚起步。鉴于H2O2和NO都是植物的信号分子,且在不同生物体系反应中信号转导途径的类同性,推测两者在植物中的信号途径中应存在相互作用。研究揭示在植物悬浮细胞中诱导细胞超敏感死亡需要NO和ROS两者之间达到某种平衡。在植物保卫细胞中,H2O2作为上游信号诱导NO的产生。在ABA信号转导途径中,H2O2可能在NO的上游起作用并受NO的负反馈调节。NO和H2O2在介导热激诱发植物细胞次生产物合成过程中存在特殊的信号互作现象。尽管人们已经把H2O2和NO联系起来,但有关两者之间的相互关系的研究还很缺乏。尤其是关于H2O2和NO在植物不定根形成与发育过程中信号作用的研究还未见文献报道。　　 对H2O2和NO信号可能构成的植物体内复杂的信号网络更深入地研究将有助于进一步揭示植物不定根形成的机制。因此,本文运用形态学、解剖学、生理学和生物学的研究方法,以万寿菊(Tagetes erecta L.‘Marvel’)为材料,研究了H2O2和NO在植物不定根形成与发育中的作用、信号转导、相互关系及其可能的生理生化机理。取得的主要结果与结论如下:　　 1.外源NO供体SNP和H2O2可显著地促进万寿菊外植体不定根的形成,且呈现明显的剂量效应,最适的SNP和H2O2浓度分别为50μM和200μM。此外,L-NAME、NaN3和DPI均能有效的抑制万寿菊外植体不定根的形成,说明内源NO和H2O2在诱导不定根的形成过程中亦起着重要的作用。　　 2.NO和H2O2共同处理的万寿菊外植体的不定根数量和根长显著大高于NO或H2O2单独处理。外源NO或H2O2能引起植物外植体内源H2O2或NO含量的增加。可见,NO和H2O2在万寿菊不定根形成过程中具有协同诱导效应,两者在促进不定根形成过程中可能通过互作反应提高各自的信号水平。　　 3.一氧化氮合酶(NOS)活性抑制剂L-NAME和硝酸还原酶(NR)抑制剂NaN3均能有效地抑制万寿菊外植体不定根的形成。因此,在万寿菊外植体不定根形成过程中至少应该存在两条内源NO的生物合成途径:NOS和NR途径。　　 4.NO和H2O2处理可提高万寿菊外植体可溶性总糖(WSC)、总碳、可溶性蛋白的含量和C/N比值以及过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)和吲哚乙酸氧化酶(IAAO)等酶的活性,同时降低外植体淀粉和总氮的含量。所以,NO和H2O2处理使得植物体内的新陈代谢旺盛,同时自我保护能力也加强,清除某些物质在植物体内的毒害,从而促进外植体不定根的形成。　　 5.在诱导植物外植体不定根形成中,IBA与外源NO和H2O2一样具有相似的促进作用。NO和H2O2是IBA诱导万寿菊不定根形成的必要条件,IBA是通过增加内源NO和H2O2水平实现对不定根的促进作用。　　 6.NO专一性猝灭剂cPTIO和NOS活性抑制剂L-NAME抑制了IBA对外植体H2O2含量的促进作用；cPTIO能抑制IBA对NPA降低内源H2O2含量的促进作用。CAT和DPI却不能抑制IBA对NO含量的促进作用:CAT不能抑制IBA对NPA降低内源NO含量的促进作用。可见,NO和H2O2是IBA诱导万寿菊不定根形成的两个平行的下游信号分子,且NO可能位于H2O2的上游。　　 7.鸟苷酸环化酶(GC)抑制剂LN83583显著降低了SNP诱导的万寿菊外植体不定根的根数和根长,细胞可透过的cGMP类似物8-Br-cGMP逆转了这种抑制作用。然而,LY83583对H2O2诱导的外植体生根没有产生抑制作用。8-Br-cGMP处理去除IAA的外植体的不定根根数和根长达到了用SNP或H2O2处理的水平。可见,cGMP的合成是万寿菊不定根形成所必须的；且cGMP参与了NO诱导万寿菊不定根形成的信号转导过程；而cGMP不包含在H2O2诱导万寿菊不定根形成的信号途径中。　　 8.cADPR合成拮抗物烟酰胺(Nic)和烟碱(NA)显著抑制了NO诱导的万寿菊外植体不定根的形成:Nic和NA对H2O2诱导的万寿菊不定根形成没有影响。这表明cADPR在NO促进生根的信号途径中起重要的作用,而cADPR并未参与H2O2促进生根的信号转导。　　 9.Ca2+通道抑制剂钌红(RR)和Ca2+鳌合剂乙二醇四乙酸(EGTA)均显著抑制了NO和H2O2诱导的万寿菊外植体不定根的根数和鲜重。说明Ca2+对促进外植体不定根形成有重要作用,Ca2+可能作为连接植物激素与NO和H2O2诱导不定根形成过程的第二信使出现。IP3调节Ca2+通道抑制剂LiCl和NEO显著抑制了NO和H2O2诱导的万寿菊外植体不定根的形成。可见,IP3在NO和H2O2诱导万寿不定根形成的信号转导途径中起重要作用。　　 10.在NO或H2O2处理万寿菊外植体24 h后出现了一条分子量为50 kD的钙依赖蛋白激酶(CDPK)蛋白条带,其活性在48 h内逐渐增加。而cPTIO抑制了NO或H2O2诱导的CDPK的活性。可见,CDPK在NO或H2O2诱导外植体不定根形成的信号途径中起重要的作用。　　 11.凝胶激酶分析表明,用IBA、SNP或H2O2处理万寿菊外植体24 h就明显诱导了一个46 kDa的MBP激酶活化。NO专一性猝灭剂cPTO明显抑制了SNP和IBA诱导的蛋白激酶的活性。H2O2清除剂CAT亦使得H2O2诱导的激酶活性消失。MAPKK抑制剂PD098059或U0126明显抑制了IBA、SNP和H2O2诱导的MBP激酶活性。这些结果说明IBA、SNP和H2O2活化的46 kDa的MBP激酶就是一种MAPK。NO诱导的MBP活化并未被GC抑制剂LY83583抑制,说明万寿菊不定根形成的MAPK信号级联是独立于cGMP信号途径。H2O2清除剂CAT明显抑制了SNP对MAPK的活化；而NO专一性猝灭剂cPTIO对H2O2活化MAPK未产生显著影响。结果说明在NO活化MAPK的信号途径中H2O2起着不可替代的作用,而H2O2对MAPK的活化独立于NO。因此,在MAPK的信号转导途径中可能存在NO→H2O2→MAPK途径。也即ONO和H2O2是MAPK信号途径中两个平行的下游信号分子,且H2O2可能位于NO的下游。