论文部分内容阅读
P11是一类在生物界广泛存在的信号转导蛋白，在微生物的氮代谢调控中起重要作用。因为利用的常规依赖SacB的方法一直没有在丝状蓝细菌中获得P11缺失突变体，所以人们对丝状蓝细菌中P11是否参与异型胞分化调控以及其他作用了解甚少。
采用双向电泳结合质谱的实验方法研究了丝状蓝细菌Anabaenasp.PCC7120中P11的修饰方式。通过Anabaenasp.PCC7120全蛋白双向电泳Westernblot，发现P11的修饰方式与单细胞蓝细菌P11的修饰方式不同，并不随氮源的改变而发生变化。在双向胶上确定对应的P11蛋白点后，对其进行MALDI-TOF-MS和nanoLC-FTICR-MS/MS分析，发现P11在Anabaenasp.PCC7120中有如下修饰方式：51位酪氨酸硝基化，17位赖氨酸乙酰化和N端切割19个氨基酸。
为了检验修饰结果及深入研究P11生理功能，我们首先在丝状蓝细菌Anabaenasp.PCC7120中构建了cre/loxP重组系统。应用此系统成功地删除了Anabaena7120中唯一编码P11蛋白的glnB基因。在此基础上，对Anabaenasp.PCC7120缺失P11的效应以及P11的修饰及生理功能进行了进一步的研究。首先，我们发现glnB突变体(MP2a)能够在缺乏氮素条件下分化异型胞，回答了P11同异型胞分化之间的关系这一长期困惑研究者的问题。P11缺失突变体在加氨，加硝酸盐或固氮条件下都生长缓慢，在有硝酸盐的培养基中生长会向胞外分泌氨，并失去了氨对硝酸盐摄取的抑制作用，谷氨酰胺合成酶活性在加氨培养时升高，在硝酸盐培养时降低，固氮生长时固氮酶活性降低。随后，我们根据获得的修饰结果，在缺失突变体基础上构建了修饰位点的点突变体Y51F，K17R和K17RY51F。由K17R点突变体双向胶Westernblot可见P11的修饰模式发生变化，被推测为第17位赖氨酸修饰的点消失了，从而证明Anabaenasp.PCC7120中P11确实存在17位赖氨酸被修饰。Y51F在没有化合态氮的条件下生长明显慢于野生型；K17R和K17RY51F在加氨，加硝酸盐或固氮条件下都明显比野生型生长慢。
在Anabaenasp.PCC7120中49位丝氨酸也非常重要。在Anabaenasp.PCC7120P11缺失突变体的基础上构建了S49A和S49E点突变体，发现S49A突变体可以抑制硝酸盐的摄取，导致S49A在硝酸盐培养基中生长可分化异型胞；S49E失去了氨对硝酸盐摄取的抑制作用，并且严重影响了固氮酶活性。通过实时定量PCR发现P11影响氮代谢调控重要转录因子NtcA的转录。P11的T-loop上重要氨基酸突变之后，即S49A，S49E，Y51F都阻止了NtcA在减氮之后的上调，并影响NtcA依赖的基因表达。这些结果表明P11可能影响了NtcA的转录调控作用。