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连翘为木犀科植物连翘Forsythia suspensa(Thunb.)Vahl的干燥果实,是我国广泛使用的传统中药材。连翘苷和连翘酯苷A是2015版《中国药典》中规定的指标性成分,用于控制连翘药材及饮片的质量。由于目前市场上连翘多为野生,连翘苷和连翘酯苷A的含量较低,同时还存在胚率较低的问题,导致药材质量无法保证,培育优质品种是解决连翘药材质量问题的最佳方法。迄今为止,对连翘的育种还尚未展开,关于连翘分子育种方面的研究较少。为了填补连翘育种领域的空白,本研究在连翘发育的五个不同时期,利用无参RNA-Seq技术,对各个时期连翘果实进行转录组测序,并通过生物技术平台筛选出与连翘苷和连翘酯苷A含量及胚发育相关的候选基因,为日后优质连翘品种的培育奠定基础。本课题的研究方法及结果如下:1.采用HPLC法,分别对6月20日至7月30日五个不同时期的连翘样品进行连翘苷和连翘酯苷A的含量测定。结果表明在此期间,随着连翘的生长发育连翘苷含量持续下降,连翘酯苷A含量先持续降低又在7月30日略微上升。2.提取上述各发育时期的连翘果实样品的总RNA进行RNA-Seq测序,五个时期的样本均得到了大于20M高质量clean reads;从头组装(de novo)获得161668条Unigenes,将其与Nr、Swiss-Prot、KEGG和KOG等数据库比对进行基因功能注释,共有93995条Unigenes得到注释;为分析连翘苷和连翘酯苷A含量及胚发育相关基因提供了参考基因序列。3.通过基因功能注释和差异表达分析,共发现了47个苯丙烷途径的基因,可能编码苯丙烷途径中苯丙氨酸解氨酶(PAL)、肉桂酸-4-羟化酶(C4H)、4-香豆酰辅酶A连接酶(4CL)、肉桂酰辅酶A还原酶(CCR)、羟基肉桂酰转移酶(HCT)、香豆酸-3-羟化酶(C3H)、肉桂醇脱氢酶(CAD)、咖啡酸-O-甲基转移酶(COMT)、咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶(CCo AOMT)共9种酶;通过功能注释及系统发育分析,发现了1个指导蛋白(DIR)基因、2个氧甲基转移酶(OMT)基因和1个葡萄糖基转移酶(UGT)基因,这些基因可能参与了连翘苷的生物合成过程,且这些基因都随连翘的发育而发生下调;通过差异表达分析发现了连翘酯苷A生物合成途径的相关基因,包括2个酪氨酸脱羧酶(Ty DC)基因、6个多酚氧化酶(PPO)基因、4个伯胺氧化酶(PAO)基因、1个醇脱氢酶(ADH)基因、6个葡萄糖基转移酶(UGT)基因、1个酰基转移酶(AT)基因和2个鼠李糖基转移酶(RT)基因,这些基因可能共同参与了连翘酯苷A的生物合成过程,其表达量变化趋势与连翘酯苷A含量变化趋势几乎一致。4.通过基因功能注释和差异表达分析共鉴定出14个葡萄糖苷酶(Glu)基因,这些基因可能参与了连翘苷及连翘酯苷A降解途径中葡萄糖苷键的水解过程;通过基因差异表达分析和系统发育分析,发现了3个α-甘露糖苷酶(AMA)基因和11个细胞色素P450还原酶(CPR)基因,这些基因可能参与了连翘酯苷A降解途径中鼠李糖基的水解和苯环的还原过程,且基因的表达量与连翘酯苷A含量变化趋势相反。5.采用体式显微镜对各个时期连翘胚的发育形态进行显微观察,结果表明6月30日连翘胚开始形成,并随着发育时间逐渐变大;通过系统发育分析及聚类分析鉴定了40个胚发育相关候选基因,包括28个PPR蛋白基因、1个丙二烯氧化物合酶(AOS)基因、6个WUSCHEL-related homeobox(WOX)基因和5个MADS-box基因,这些基因可能参与了连翘胚的发育过程,且在6月20日至7月30日持续表达。