癌症作为一种难治愈的疾病严重威胁着人类的健康。据权威机构统计,全球每年有接近800多万遭受癌症的折磨,所以更高效、低副作用的抗癌药物的合成具有重要的研究意义。然而核苷类似物以及羟基脲等常用抗癌药物有许多弊端,如对细胞毒性大、口服效率低以及靶向性能差等,这就限制了这些抗癌药物在临床上的应用。因此,合成靶向性更强、更加高效低毒的抗肿瘤药物衍生物,成为药物化学领域的研究热点。前体药物也称前药,是指药物经过化学修饰后得到的抗肿瘤药物的衍生物。这些衍生化后的药物在体外不发挥作用或发挥作用较小,当经体内特定途径转化后,可以发挥药物疗效。目前,前药的合成通常采用化学法,但是化学法合成反应往往存在步骤复杂,副产物多以及不易纯化等问题。生物酶催化方法是一种新的催化方式,其催化条件温和,操作简便等优点。目前有关酶法合成前药的报道较少,在已报道的研究中,大部分是利用葡萄糖或半乳糖进行原药的糖基化修饰。鼠李糖基化合物是一种重要的糖苷类化合物,广泛的存在于天然化合物中,例如类黄酮、花青素、三萜烯类以及植物细胞壁组分中等,是一种具有非常重要生物活性的物质。研究报道,一些肿瘤细胞表面存在有可以特异性识别鼠李糖的受体,带有鼠李糖基的化合物可以选择性的与肿瘤细胞表面受体结合,如果对抗肿瘤药物进行鼠李糖基化修饰,可能会增加药物的靶向性。除肠道微生物,人体内不存在鼠李糖苷酶。根据酶催化活化前药的原理,将鼠李糖基化的抗肿瘤药物与能够靶向的外源添加的鼠李糖苷酶相结合,可以定向释放抗肿瘤药物,减少抗肿瘤药物的给药剂量及其对正常细胞的损害,并具有一定的靶向疗效。α-L-鼠李糖苷酶是一种糖苷水解酶,既可以催化糖苷化合物非还原端α-L-鼠李糖苷键的断裂,也可以在热力学控制下催化逆水解反应,利用L-鼠李糖单体为供体,合成鼠李糖基化产物。本论文利用来自于Alternaria sp.L1的α-L-鼠李糖苷酶(RhaL1)催化逆水解反应,反应以L-鼠李糖为供体,以抗肿瘤药物羟基脲、5-氟-2’-脱氧脲核苷和阿糖胞苷为糖基受体,进行鼠李糖基化反应,并且优化了以5-氟-2’-脱氧脲核苷和阿糖胞苷为受体的糖苷合成反应的条件,在实验室前期工作的基础上又合成了一种新型的抗肿瘤药物鼠李糖苷化合物,产物经过高效液相色谱法、凝胶过滤层析法以及TLC硅胶回收法进行分离、纯化。质谱鉴定了 5’-O-α-L-鼠李糖基-阿糖胞苷和羟基脲鼠李糖苷的分子量,利用核磁共振技术解析了两种鼠李糖苷化合物的化学结构。利用合成的三类抗肿瘤药物衍生物,初步进行了体外抗肿瘤活性实验,通过MTT法分别检测了三类鼠李糖苷化合物对MDA-MB-231与MCF-7等人乳腺癌细胞增殖的影响,并比较了鼠李糖苷化合物与细胞孵育时加鼠李糖苷酶或不加酶两种情况下对肿瘤细胞的抑制作用。研究发现,抗肿瘤药物的鼠李糖苷化合物对肿瘤细胞的生长没有明显的抑制活性,当加入外源鼠李糖苷酶对其进行催化水解后,具有抗肿瘤活性的原药被释放,进而重新发挥抑制细胞生长的活性,并且其抑制效果呈浓度依赖性,与原药的抑制效果无统计学的差异。对于抗肿瘤药物的鼠李糖苷化合物的酶法合成,由于原始酶催化的产量较低,我们接下来对原始酶进行了分子改造,以提高其催化效率,并进一步研究该家族的鼠李糖苷酶的催化机理。我们组前期的工作,通过蛋白质氨基酸序列比对和以已知晶体结构Streptomyces avermitilis来源的α-L-鼠李糖苷酶(SaRha78A)为模板进行3D建模,根据推测的催化活性位点进行氨基酸定点突变,选择1 1个氨基酸残基进行定点突变,获得了 12个突变株(D252N,D257N,D264N,W261Y,W261A,Y302F,Y316F,W369Y,E530Q,R548A,H553A 和 W555A)。本论文以甘露醇为受体,通过测定酶的逆水解活性筛选出三种催化合成效率较原始酶高的突变酶(W261Y,Y302F和Y316F),其中突变酶W261Y的催化合成效率最高,比原始酶提高了约44%。通过以pNPR为底物的酶的水解催化动力学研究发现其kcat值(2.46±0.32)×1 0-2)比原始酶的kcat值(3.07±0.16)降低了近100倍,但是Km(1.31±0.50 mM)几乎与原始酶(1.47±0.22 mM)相同,说明该位点由Trp突变为Tyr后水解活性大幅降低,但是并没有改变酶与底物的结合效率。对突变酶W261Y进行酶学性质的测定发现,该酶的最适温度和温度稳定性与原始酶相似,但该酶的最适pH与原始酶相比,从6.5降为3.5,并且突变酶在酸性环境中的稳定性较原始酶大为提高,在pH为2.5的缓冲液中放置过夜后,突变酶仍保持近100%的酶活而原始酶只有不到10%的酶活。推测酶催化活性中心附近氨基酸极性的改变影响了含有羧基的氨基酸的酸度系数,使原始酶pH的依赖性发生变化。