饮食、运动、应激和睡眠等生活方式的改变是全球超重和肥胖成流行趋势的重要原因。而我国由于近些年经济的迅速增长及人口数量多,己成为全球肥胖人口最多的国家。肥胖及与肥胖相关的其他疾病如脂代谢紊乱、高甘油三酯血症、胰岛素抵抗(IR),2型糖尿病(T2DM),冠心病(CVD)和非酒精性脂肪肝疾病,又称代谢综合征患病率也随之上升。给社会和家庭都带来了极大的经济负担和痛苦。故若能找到其病因并采取合理有效的办法来预防、治疗该类疾病,将会造福整个社会和广大的患者。大量研究证实,肥胖和2型糖尿病时,血清中α-1酸性糖蛋白、淀粉样蛋白A、CRP、IL-6、TNF-α和IL-β等炎症因子升高,同时,脂肪、胰腺、骨骼肌等外周组织中可见各种免疫细胞浸润,提示肥胖和2型糖尿病均属于炎症性疾病,但这种炎症状态与经典的,如细菌感染导致的炎症不一样,不伴随感染、无大面积的组织损伤,炎症激活状态也不强烈,故称之为“慢性低滴度炎症”、“副炎症”或“代谢性炎症”,意为由代谢因素诱发的炎症,但不管如何命名,目前关于此炎症的发生机制尚不清楚。巨噬细胞,机体固有免疫细胞的重要成员之一,来源于骨髓造血干细胞,在骨髓中分化为单核细胞后释放入外周循环中。在感染存在的情况下,单核细胞进入感染的组织,分化为巨噬细胞,他们通过吞噬或细胞因子来清除和杀伤受感染的细胞来保护机体,并产生化学趋向因子募集其他免疫细胞集聚到炎症部位,分泌的促炎因子尚可以再活化其他免疫细胞。除了在经典炎症中的作用外,巨噬细胞也参与到了肥胖和2型糖尿病的发生发展中。肥胖和2型糖尿病的动物模型和患者的脂肪组织中发现有大量的巨噬细胞浸润,且脂肪细胞增生的数量与浸润的巨噬细胞的严重程度相关。进一步证明,脂肪组织的巨噬细胞是促炎因子TNF-α的主要来源,在3T3-L1脂肪细胞中用TNF-α处理后可以干扰胰岛素信号通路,出现胰岛素抵抗。相反,敲除TNF-α或其受体TNF-受体1的小鼠高脂诱导下不易出现胰岛素抵抗。随后证实,脂肪组织来源的细胞因子包括IL-6,IL-β和趋化因子CCL-2在肥胖时表达均增多,即脂肪组织的巨噬细胞连接着肥胖、胰岛素抵抗和2型糖尿病的重要枢纽。除此之外,在临床上发现,肥胖和2型糖尿病患者的血中单核细胞增多,单核细胞的变化与动脉粥样硬化、冠心病及脑卒中的发生、预后关系密切,在动物模型中,也发现ob/ob的小鼠高脂诱导后循环中的单核细胞增多,可能与骨髓造血干细胞功能增加由关。另外有少部分研究显示肥胖时组织中浸润增加的巨噬细胞可能来源于骨髓和外周循环的单核细胞,但另一些研究却显示是组织局部的常驻巨噬细胞增生所致。总之,关于肥胖和2型糖尿病组织中的巨噬细胞和循环中的单核细胞关系尚不明确,故本研究以此为出发点,设计以下两部分实验,以探讨单核巨噬细胞系统在肥胖发生发展中的作用。第一部分高脂饮食诱导下C57BL/6J小鼠外周血和骨髓中单核细胞的变化特点目的肥胖导致的脂肪组织,特别是腹部网膜组织巨噬细胞浸润,是胰岛素抵抗和2型糖尿病发病的关键环节,而关于巨噬细胞的活化和来源,目前机制不明。正常情况下,外周血的单核细胞进入组织中后可以分化为巨噬细胞,有报道称肥胖和2型糖尿病时,血中的单核细胞增加,但在有诱发因素(高脂、高糖、运动量减少、饮酒等)出现到机体变成肥胖这个动态变化过程中,单核细胞的变化特点,尚无报道。故本研究拟从动态角度,观察高脂饮食下,不同时期小鼠外周血单核细胞的变化情况,来探讨外周血单核细胞在肥胖发生发展过程中的作用。方法1.5-6周龄的C57BL/6J小鼠经适应性饲养1周后,随机分为两组,高脂饮食组予60%脂肪饲料,低脂饮食组予10%脂肪饲料,分别于3天、7天、15天、4周、12周、15周和19周时,每组各取4-5只小鼠(19周10只/组),眼眶静脉丛取血,置于EDTA处理过的采血管中,然后取其100 μ l,2 μ lCD16/32阻断Fcr受体后,加入不同的抗体,PE-CD115,APC-CD11b,Alexa Flour 430-Ly6C,CD11c-FITC并置于冰上孵育30分钟,再加入红细胞裂解液,4 ℃离心机15000rpm离心5分钟,加入300-500 μl FACS重悬细胞,最终加入15 μl的count Beads(15000/μl),流式细胞仪检测细胞,Flowjo7.0软件处理图像,Prism7.0进入数据处理,结果以X±平均数表示,统计方法采用两个样本的独立t检验进行统计处理,P<0.05为有统计学意义;2.第3天、4周、8周和15周时,外周采血后,颈椎脱臼法杀死小鼠,充分暴露双下肢,镊子和剪刀协助下游离胫骨和股骨周围的血管、肌肉,取下胫骨和股骨后用剪刀剪断两端,用含2mM的FACS溶液冲洗骨髓细胞,4℃1500rpm离心5分钟后,加入红细胞裂解液,室温下静置2分钟,期间轻轻晃动,充分裂解,加用FACS4℃1500rpm离心5分钟,弃去上清液,再加500 μlFACS 溶液重悬细胞,取 100 μl 依次加入PE-CD115,APC-CD11b,Alexa Flour 430-Ly6C抗体,避光冰上孵育30分钟后,加入3ml FACS溶液,4℃的低温1500rpm离心5分钟,加入500 μlFACS溶液重悬细胞,同步骤1流式细胞仪检测细胞,Flowjo7.0软件处理图像,Prism7.0进入数据处理,结果以X±平均数表示,统计方法采用两个样本的独立t检验进行统计处理,P<0.05为有统计学意义;3.组织学分析:以3天和15周分别代表本实验的早期和晚期,免疫荧光组织化学检测高脂饮食组和低脂饮食组中网膜脂肪组织和胰腺组织巨噬细胞的表达情况;4.内脏脂肪组织的SVF提取和RT-PCR:高脂饮食1周后,取小鼠性腺周围的脂肪组织,PBS冲洗,Ⅱ型胶原酶溶液37℃充分消化30-40分钟,EDTA终止消化,4℃ 1500rpm 离心 5-10 分钟,得到 SVF(stromal vascular fraction),用1×PBS重悬细胞为1 × 106/ml,加入1.2ul live/dead标记死细胞后,依次加入相应剂量的 CD16/32,FITC-F4/80,Percp-Cy5.5-CD11b,PE-CD11c,Alexa Flour430-CD45抗体,余步骤同外周血单核细胞的流式细胞学检测;同时用经典的Trizol方法提取内脏脂肪组织RNA,RT-PCR检测CCL2mRNA的含量,2-△ACT法计算两组间的相对表达量,统计方法采用两个样本的独立t检验进行统计处理,P<0.05为有统计学意义结果1.体重:与低脂饮食组相比,高脂饮食组体重自6周开始,体重明显高于低脂饮食组,两组比较P<0.05,具有统计学意义;2.血糖:整个实验期间,约2周同一时间点(下午3-4点)测小鼠随机血糖1次,单位以mg/dl表示,结果显示,整个实验期间,两组之间血糖数值P>0.05,无统计学意义;3.外周循环中单核细胞变化情况:与低脂饮食中相比,高脂饮食组外周血中单核细胞所占百分比自第3天开始下降,15天下降最明显,有统计学意义(P<0.05),4周开始,两组之间单核细胞百分比无明显差别(P>0.05),19周时两组之间单核细胞百分比仍无明显差别(P>0.05)。用count Beads计算各组间单核细胞绝对数后(cell number/μl)发现,高脂饮食组外周血中单核细胞数量自第3天开始下降,15天下降最明显,有统计学意义(P<0.05);19周时,血中单核细胞数量有增加趋势,但两组比较,无统计学意义(P>0.05);4.血中Ly6C-hi单核细胞变化情况:两组相比,第3天,高脂饮食组血中Ly6C-hi单核细胞的百分比下降,两组相比,有统计学差异(P<0.05);15周时,高脂饮食组血中Ly6C-hi单核细胞的百分比较低脂组上升。用count Beads计算各组间细胞绝对数后(cellnumber/μl)发现,高脂饮食组外周血中Ly6C-hi单核细胞数量自第3天开始下降,15天下降最明显,有统计学意义(P<0.05);15周时高脂组Ly6C-hi单核细胞数量开始上升,19周时,高脂组中Ly6C-hi单核细胞数量与低脂组相比,明显升高,差异有统计学意义(P<0.05);5.血中Ly6C-low单核细胞变化情况:两组相比,第3天,高脂饮食组血中Ly6C-low单核细胞的百分比增加,两组相比,有统计学差异(P<0.05);15周时,高脂饮食组血中Ly6C-low单核细胞的百分比较低脂组下降,有统计学差异(P<0.05)。用count Beads计算各组间细胞绝对数后(cell number/μ 1)发现,高脂饮食组外周血中Ly6C-low单核细胞数量自第3天开始下降,7天和15天下降均比较明显,有统计学意义(P<0.05);15周时高脂组Ly6C-low单核细胞数量仍较低脂组低,但19周时,高脂饮食组中Ly6C-low单核细胞数量与低脂组相比,开始升高,但差异无统计学意义(P>0.05);6.骨髓中单核细胞变化情况:第3天时,与低脂饮食组相比,骨髓中单核细胞及Ly6c-hi或ly6c-lo百分比两组相比,均无统计学意义(P>0.05),4周、8周时两组间比较,差异亦无统计学意义(资料未显示,P>0.05),但15周时骨髓中单核细胞和ly6c-lo、ly6c-hi单核细胞开始增加,差异有统计学意义(P<0.05);7.脂肪组织中巨噬细胞表达情况:3天时,低脂饮食组的脂肪组织,脂肪细胞大小比较均一,巨噬细胞比较小,孤立的、散在分布在脂肪细胞之间,很少见聚集;相反,高脂饮食组,脂肪大小不一,巨噬细胞数量增加,并可见聚集现象;随饮食时间延长,到15周时,无论低脂饮食组还是高脂饮食组的脂肪细胞大小均较3天时增加,高脂饮食组增加更明显,且可见巨噬细胞聚集,呈典型的冠样结果(crown like structures,CLS),提示脂肪组织的炎性浸润;8.胰腺组织中巨噬细胞表达情况:第3天时巨噬细胞浸润两组表现差别不大,15天时高脂饮食组巨噬细胞略增加,随着高脂饮食的时间延长(12周和19周),可见巨噬细胞数量明显增加;9.高脂饮食1周,CD11c在单核细胞和脂肪巨噬细胞中表达情况:高脂饮食1周,与低脂饮食组相比,外周血ly6c-lowCD11c+单核细胞比例增加,脂肪组织CD11b+F4/80+CD11c+巨噬细胞比例增加,RT-PCR检测脂肪组织中CCL2mRNA的表达增加。结论1.高脂饮食诱导下,外周循环单核细胞早期减少,后期增加,骨髓中单核细胞早期无变化,故早期脂肪组织中浸润增加的巨噬细胞与外周循环中的Ly6C-low单核细胞比例增加可能有关,后期(特别是19周)脂肪组织的巨噬细胞可能与外周循环中的Ly6C-hi单核细胞有关;2.高脂饮食诱导下,胰腺组织巨噬细胞浸润时间晚于内脏脂肪组织,内脏脂肪脂肪浸润可能是肥胖发生过程中首先累及的器官;3.Ly6c-low CD11c+单核细胞可能参与了早期(高脂饮食1周)外周血单核细胞向脂肪组织中巨噬细胞的转化。第二部分高脂饮食对C57BL/6J小鼠骨髓造血干细胞的影响目的外周血和骨髓中的单核细胞主要来源于骨髓中的普通髓系祖细胞,如第一部分所示,高脂饮食时,外周血中单核细胞呈早期减少,后期增加,骨髓单核细胞早期无变化,后期增加,那么,高脂饮食是否对骨髓造血干细胞有影响,这种影响是否参与了外周循环单核细胞的变化?故本研究在前一步部分的基础上,观察高脂饮食下,不同时期小鼠骨髓单核细胞和及其前体骨髓造血干细胞的变化情况,来探讨肥胖发生发展过程中,血中单核细胞变化的来源及机制。方法5-6周龄的C57BL/6J小鼠经适应性饲养1周后,随机分为两组,高脂饮食组予60%脂肪饲料,低脂饮食组予10%脂肪饲料,分别于3天,7天,15天,15周和19周时,每组各取5只小鼠(19周10只),颈椎脱臼法处理小鼠后,分离其四肢胫骨,剪刀剪断两断,1.5ml注射器(27#或25#针头)吸取1mlFACS冲洗骨髓细胞于5ml EP管中,加入红细胞裂解液,4 ℃C离心机15000rpm离心5分钟,最后加入500 μl FACS重悬细胞,取100 μl骨髓细胞进行抗体标记,先每组加入2 μ 1CD16/32-FITC阻断Fcr受体,lin-抗体(每管每种抗体2 μ l,共12μl),冰上孵育30分钟后,FACS冲洗,再加入不同的抗体,Qdot-605-Lin-,APC-CD11b,PE-c-kit,AlexaFlour430-CD34,FITC-CD16/32,Percp-Cy5-5-Flt3标记骨髓造血干细胞,冰上孵育30分钟后,加入FACS,4℃离心机15000rpm离心5分钟洗涤细胞后,加入500 μl FACS重悬细胞,同时设立对照管,流式细胞仪检测细胞,Flowjo7.0软件处理图像,Prism 7.0进入数据处理,结果以X±平均数表示,统计方法采用两个样本的独立t检验进行统计处理,P<0.05为有统计学意义。结果骨髓造血干细胞各亚群细胞占骨髓Lin-百分比的变化特点:1)Lin-细胞群:第15天时,高脂饮食组Lin-细胞群细胞数,与低脂组相比减少,差别有统计学差异(P<0.05);2)sacl-ckit+细胞群,第3天、15周时两组间比较有统计学意义,高脂饮食组细胞数减少(P<0.05);3)CMP细胞群:两组相比,第3天时,高脂饮食组百分比较低脂组较多,差异有统计学意义(P<0.05),GMP群7两组间整个实验时间段,两组相比,无差异;4)LT-HSC细胞群,第7天时,两组细胞数相比有统计学差异(P<0.05),其中高脂饮食组明显减低;5)MPP细胞群,两组间相比,第15天时,高脂饮食组较低脂饮食组减少,差异有统计学意义(P<0.05);5)19周时,两组相比,整个骨髓造血干细胞各亚群无明显差异(P>0.05)。结论1.高脂饮食诱导下,骨髓造血干细胞的定向分化功能发生改变,各亚群之间的比例发生重新调整;2.高脂饮食下,骨髓造血干细胞早期处于抑制状态,第3天时,各亚群受抑制最明显,且这种变化早于外周循环的单核细胞(第15天)。