背景子宫内膜异位症(内异症,endometriosis, EMs)是指具有生长功能的子宫内膜组织生长在子宫腔以外的其他部位而产生的病变。EMs是育龄妇女的常见病,发病率在育龄妇女中约为10-15%,在不孕妇女中的发病率约占50%。临床表现为痛经、月经不调、腹腔疼痛、性交疼痛、不孕等。EMs的发病机理并不明确,经血逆流学说与异常的腹腔免疫环境被认为是EMs发生发展的重要因素。逆流进腹腔的子宫内膜细胞逃脱了免疫细胞的监视,被“允许”在腹腔中种植。内异症患者异位组织、血液及腹腔液中受核转录因子NF-κB途径调控的IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8及TGF-β1等炎症因子的含量显著升高,这些炎症因子在异位组织侵袭、粘附、异位子宫内膜细胞增殖、异位组织血管生成等方面都起到了促进作用。巨噬细胞作为腹腔中占主导地位的免疫细胞,在内异症的形成和发展中扮演着重要角色。内异症患者腹腔巨噬细胞数量增多,抗原递呈能力减弱,吞噬能力减弱,分泌能力增加。这些变化促进了内异症的发生发展。内异消是课题组自主创制的抗子宫内膜异位症的中药新药,由川芎嗪、阿魏酸、延胡索乙素3种中药单体有效成分组成的复方药物,已申报国家技术发明专利,并得到科技部“重大新药创制”重庆孵化基地专项资助。本研究观察内异消对大鼠子宫内膜异位症的治疗作用,并以免疫环境为切入点,以动物整体实验和细胞实验探讨药物作用机制。为内异消提供抗子宫内膜异位症的主要药效学及其作用机制的试验基础。目的观察内异消对大鼠子宫内膜异位症的治疗作用及对相关免疫系统的调节作用,为将内异消研制成为抗子宫内膜异位症的中药新药提供主要药效学试验依据,并阐释其在免疫调节方面的作用机制。方法(1)造模及模型成功标准选取性周期正常的SD大鼠,于动情期采用自体移植法,取子宫内膜组织缝于腹腔壁上,建立大鼠子宫内膜异位症模型。28天后,游标卡尺测量移植物长、宽、高,以移植物长大体积≥8mm3且表面有血管生成,随机抽取异位组织进行病理检测,证实是存活的子宫内膜组织为模型成功标准。(2)分组与给药取造模成功的大鼠随机分为空白组,模型组,孕三烯酮组,内异消0.18 g·kg-1组,0.09 g·kg-1组,0.045 g·kg-1组。用药前经SPSS13.0统计分析,各组间异位组织体积无显著差异(P>0.05)。连续灌胃给药28天,每天1次。(3)内异消抗大鼠子宫内膜异位症疗效观察给药28天后,测量异位组织体积,观察给药后异位组织体积,给药前后异位组织体积变化及体积变化率;常规HE染色,观察异位组织形态变化；取脾脏组织称重,计算脾脏指数。(4)内异消对子宫内膜异位症大鼠炎症因子的影响给药28天后,乙醚麻醉大鼠,取血、腹腔液及异位组织；ELISA法检测血清及腹腔液中TNF-α、IL-1β的含量；免疫组织化学法检测异位组织中IL-6、IL-8、TGF-β1及IκBα的表达,以阳性表达个数为观察指标；Western blot法检测异位组织中IKBa的表达。(5)内异消对子宫内膜异位症大鼠腹腔巨噬细胞活性的影响给药28天后,于末次给药30分钟后乙醚麻醉大鼠,取血,分别制备空白组,模型组,孕三烯酮组,内异消0.18 g·kg-1灌胃给药组、内异消0.09 g·kg-1灌胃给药组、内异消0.045g·kg-1灌胃给药组含药血清。取血后分别取各组大鼠腹腔巨噬细胞常规培养,除空白组外,各组加入10μg·mL-1LPS刺激,同时分别给予相应各组含药血清。采用MTT法检测巨噬细胞增殖能力,中性红法检测巨噬细胞吞噬能力,ELISA去检测上清液中TNF-α、IL-1β含量,western blot检测巨噬细胞中IKBa的表达。结果(1)内异消对内异症大鼠异位组织及脾脏指数的影响与模型组比较,内异消0.18 g·kg-1,0.09 g·kg-1,0.045 g·kg-1能够显著减小内异症大鼠异位组织体积(P<0.05),且抑制率与药物剂量呈正相关。显微形态显示：与模型组比较,内异消0.18 g·kg-1,0.09 g·kg"1,0.045 g·kg-1组能够减轻异位组织病理改变程度,异位内膜功能层变薄,细胞结构变松散。与模型组相比,内异消0.18 g·kg-1组能够显著增加大鼠脾脏指数(P<0.05)。(2)内异消对内异症大鼠异位组织中炎症因子的影响免疫组化法观察显示,与模型组比较,内异消0.18 g·kg-1,0.09 g·kg-1,0.045 g·kg-1能够显著减少异位组织中IL-6、TGF-β1的表达,增加IκBα的表达(P<0.01),内异消0.18 g·kg-1,0.09 g·kg-1能够显著减少异位组织中IL-8的表达(P<0.01)；W-B法观察结果显示内异消0.18 g·kg-1,0.09 g·kg-1,0.045 g·kg-1能够增加IκBα的表达(P<0.01)。(3)内异消对内异症大鼠血液及腹腔液中炎症因子的影响内异消0.18g·kg-1,0.09 g·kg-1能够显著减少血液及腹腔液中TNF-α、IL-1β的含量(P<0.05)。(4)内异消含药血清对内异症大鼠腹腔巨噬细胞的影响与模型组比较,内异消0.18 g·kg-,0.09g·kg-1,0.045g·kg-1灌胃给药组含药血清对腹腔巨噬细胞数量无显著影响(P>0.05),显著减少上清液中TNF-α、IL-1β含量(P<0.05),显著提高巨噬细胞中IκBα的含量(P<0.05),0.18 g·kg-1灌胃给药组含药血清能够显著提高巨噬细胞的吞噬能力(P<0.05)。结论(1)内异消能够显著减小内异症大鼠异位组织体积,减轻异位组织病理改变。其机制可能是通过抑制IκBα降解,调节NF-κB核转录途径,从而减少异位组织、中炎症因子的表达；通过减少血液及腹腔液中细胞因子的含量,改善机体免疫环境,达到治疗作用。(2)内异消含药血清能够在不影响巨噬细胞数量的前提下,提高巨噬细胞的吞噬能力,降低巨噬细胞的分泌能力,减弱NF-κB的活化,提示内异消治疗大鼠子宫内膜异位症的机制可能与调节巨噬细胞功能有关。