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较强的就巢性和肝脏脂肪酸合成与储存能力是鹅的两大特点。miRNAs可以对基因表达进行转录后调控。浙东白鹅为江浙一带主要的鹅地方品种,具有强烈的就巢性。朗德鹅肝脏具有很强的脂肪酸合成能力与储存能力,是生成鹅肥肝的主要鹅品种。本试验通过高通量测序技术分别研究了与浙东白鹅就巢性状相关和与朗德鹅肥肝形成相关的miRNAs.除此以外,对朗德鹅肝脏脂肪代谢机理进行了更深一步的研究。包括采用RNA-Seq技术对正常饲养的朗德鹅和填饲朗德鹅的肝脏进行转录组测序；选择测序结果中差异表达的基因中与肝脏脂肪酸合成相关的基因,对其序列进行扩增；并对这些基因的组织特异性进行了分析；最后在细胞水平研究了硬脂酸、亚油酸、葡萄糖和胰岛素对这些基因表达的影响。主要研究结果如下：1、与浙东白鹅就巢性状相关miRNAs的研究鹅就巢行为主要受下丘脑-垂体-性腺轴调控。运用高通量测序技术和生物信息学分析,我们对处于就巢期和产蛋期浙东白鹅下丘脑中miRNAs的表达谱进行了分析。在就巢组和产蛋组鹅下丘脑中,我们分别获得了11053784条序列和8801405条序列。在这些小RNA序列中,miRNAs在其中所占的比例最高,分别在就巢组和产蛋组中占小RNA总数的75.61%和79.82%。对这些小RNA的长度分布进行分析得出22 nt的小RNA所占比例最高。下丘脑中表达量最高的miRNA家族为Let-7。对就巢组和产蛋组中差异表达的miRNAs进行分析,我们鉴定出38种在就巢组中表达上调的miRNAs和14种表达下调的niRNAs(至少在一个组中阅读数大于1000,且变化倍数大于2,P<0.001)。在这些差异表达的miRNAs中,niR-30d, miR-30e, miR-148a-3p, miR-30a和niR-146c在两个试验组中都具有很高的表达量。除了已知miRNAs外,我们还在下丘脑中发现158种新niRNAs,包括在就巢组发现的114种新miRNAs和产蛋组中发现的94种新miRNAs.我们列出了其中12种阅读数至少在一组中大于100的新miRNAs.在这12种新miRNAs中,有1种在就巢组中表达显著下调,有3种在就巢组中表达显著上调。2、与朗德鹅肥肝形成相关的miRNAs的研究朗德鹅肝脏具有很强的脂肪酸沉积能力。经过21 d填饲后,与正常饲喂朗德鹅相比,其在体重增加了1.5倍的同时,肝重增长了4倍。组织学观察可在肝脏中观察到大量的脂滴。通过高通量测序和生物信息学分析,我们分别在正常肝和肥肝中检测出10396977条和11321273条序列,这其中分别有88.92%和86.98%的序列为miRNAs.对小RNAs的长度分布分析得出22 nt的小RNAs所占比例最高。miR-122在肝脏中的表达量非常高,在对照组和填饲组中分别占1niRNA总量的70.34%和72.01%,但miR-122在两个试验组间表达无显著性差异。与对照组肝脏相比,我们在肥肝中鉴定出22个表达上调的miRNAs和12个表达下调的miRNAs(归一化表达量至少在一组中大于100.0,改变倍数大于2且P<0.001)。miR-222和miR-30d分别为上调和下调的miRNAs中表达量最高的。在鹅肝脏中,我们共鉴定出67种新miRNAs,其中有3种在两组间差异表达(至少在一组中归一化表达量大于10.0,且变化倍数大于2,P<0.001)。在miR-125b对预测靶基因ACSL1的miRNA/mRNA相互作用的验证试验中,转入miR-125b mimic与转入阴性对照相比,构建的ACSLJ基因3’-UTR的荧光素酶活性降低为阴性对照组的57.3%。3、运用RNA-Seq技术分析朗德鹅填饲后转录水平的变化情况运用RNA-Seq技术分析正常饲喂与填饲朗德鹅肝脏的转录组,我们分别在对照组和填饲组肝脏中获得了50198914条和49172954条reads.与参考基因组比对上的reads分别在两组占了52.85%和48.74%。与参考基因比对上的reads分别在两组中占总reads的36.61%和32.88%。两个试验组中存在最多的可变剪接类型为3’端可变剪接,其次为5’端可变剪接。以FADS2基因为例,我们共检测到5种可变剪接。对两个试验组中基因的转录水平进行比较,我们在填饲组鹅肥肝中共检测到602个表达上调的基因和200个表达下调的基因。在这些差异表达的基因中,我们筛选出与糖类代谢和脂类代谢相关的33个表达上调的基因和13个表达下调的基因。在这些基因中,表达下调的基因ACSL1, HMGCS1与表达上调的基因PDGDS, CYP2C45, FADS1, FADS1, Elovl6,17β-HSD, FAS, AACS, SCDl在肝脏都有很高的表达水平。4、脂肪酸合成相关基因的克隆与组织表达本试验克隆的ACSL1基因cDNA序列共3709 bp,其中包括119 bp的5’非编码区(5’-UTR),2097bp的编码区(CDS区)和1493 bp的3’非编码区(3’-UTR)。CDS序列编码699个氨基酸,与鸭和鸡同源性分别为98.14%和93.71%。在填饲后,肝脏和肾脏中ACSL1基因表达显著下调,腹脂和心脏中ACSL1基因表达显著上调。与对照组相比,肝脏中SCD1基因表达量在填饲后增长了22.23倍,在胸肌、腿肌和腹脂中表达量也显著上升。本试验克隆的Elol6基因cDNA片段序列共2782 bp。其中包括74 bp的5’-UTR,798 bp的CDS区和1909 bp的3’-UTR。 CDS共编码了266个氨基酸,与鸡氨基酸序列的同源性为98.49%。填饲后,肝和脾中Elovl6的表达量显著升高,分别增长了2.04倍和6.02倍。扩增的FADS1基因cDNA全序列全长3147bp,其中包括314 bp的5’-UTR区,1083 bp的CDS区和1750 bp的3’-UTR区。CDS区编码361个氨基酸,氨基酸序列与鸭的同源性为98.61%,而与鸡只有79.14%。填饲后,该基因在肝脏和脾中的表达量分别增长了2.61倍和2.89倍。克隆的鹅FADS2基因CDS序列全长1335 bp,共编码445个氨基酸,与鸭和鸡的同源性分别为97.07%和93.69%。填饲后,肝脏中FADS2基因的表达量增加了3.09倍。5、硬脂酸、亚油酸、葡萄糖和胰岛素对鹅原代肝细胞脂质沉积和脂肪酸合成相关基因表达的影响通过不同浓度的硬脂酸(SA)、亚油酸(LA)、葡萄糖和胰岛素处理鹅原代肝细胞24 h,检测细胞脂质积累情况和脂肪酸合成相关基因的表达变化情况。结果表明,与对照组相比,低浓度的SA和LA(50μM和100μM)可以诱导细胞脂肪沉积,而高浓度(150 μM)对细胞脂肪沉积无显著影响。低浓度的葡萄糖和胰岛素对细胞脂肪沉积影响较小,而高浓度葡萄糖(100 mM)和胰岛素(200 nM)对其具有较强的刺激作用。不同浓度SA都可以刺激FAS, FADS1和Elov15基因表述,100μM的SA可以刺激ACSL1表达,150μM的SA使SCD1基因表达上调。不同浓度的LA可以刺激FAS,FADS1,Elovl5和ACSLl的表达,50 μM的LA可以上调FADS2表达。不同浓度的葡萄糖可以诱导FAS, Elovl5表达,50 mM和100 mM的葡萄糖可以刺激SCD1和Elovl6表达,100 mM的葡萄糖还可以上调FADS1和Elovl2基因表达,而50 mM葡萄糖处理组中ACSL1基因表达显著下降。高浓度的胰岛素(200nM)可以刺激FAS, SCD1, Elol6, Elovl5和ACSL1基因表达。