论文部分内容阅读
目的:2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)是一种复杂的、异质性多基因疾病,以高血糖和胰岛素抵抗为特征。目前T2DM在全世界普遍流行,可引起多种代谢紊乱,导致多种心血管并发症,如心律失常、心肌病、冠状动脉粥样硬化和心力衰竭等,增加心房颤动(atrial fibrillation,AF)等房性心律失常的发生风险。预防和治疗T2DM相关的心血管并发症是目前临床上亟需解决的问题。AF作为一种复杂的电生理变化导致的功能性紊乱,是T2DM导致的临床上的重要并发症之一,可增加患者的死亡率。目前认为心房离子通道重构是AF发生的主要原因。但由于重构机制复杂,糖尿病诱发AF的病理生理机制尚未完全阐明,AF的治疗也一直是临床上的难点之一。因此,全面了解各类离子通道在糖尿病心房的重构机制对于糖尿病导致的心律失常的治疗具有重要的意义。多项研究表明,二甲双胍(metformin,Met)作为治疗糖尿病的一线药物,在改善糖、脂代谢和胰岛素抵抗的的基础上可以减少糖尿病患者发生AF的风险,被证实有独立于降糖作用之外的减轻机体氧化应激和炎症反应的作用,但分子机制尚不完全清楚。现已证实发生AF的重要基础就是心房离子通道重构。然而,二甲双胍对糖尿病心房离子通道重构影响的研究较少,其分子机制尚不清楚。近年来研究发现,小电导钙激活钾通道(small conductance calcium-activated potassium channels,SK channels)重构与AF的发生密切相关。SK通道广泛存在于心肌细胞膜,参与动作电位的形成,在调节心肌细胞去极化及维持心脏正常电活动中起着重要作用。我们先前研究发现二甲双胍可调节T2DM大鼠心房SK通道离子电流及其两个亚型SK2、SK3的mRNA和蛋白表达,但信号分子机制尚不明确。蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)/细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)信号通路和烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸氧化酶4(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 4,NOX4)/p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase,p38MAPK)信号通路在心血管系统广泛存在,对调节心脏电生理和功能发挥着重要作用。糖尿病时存在的高血糖能激活心肌PKC/ERK和NOX4/p38MAPK信号通路,促进多种炎症因子的释放,导致机体损伤。有研究证实二甲双胍在体内可抑制PKC/ERK和NOX4/p38MAPK信号通路的活化,阻断炎症介质的释放,发挥对机体的保护作用。然而,该信号通路是否参与T2DM大鼠心房SK2、SK3通道的调控以及二甲双胍是否通过该信号通路调节SK2、SK3通道蛋白需进一步的研究来证实。我们这个研究的目的是验证二甲双胍是否通过PKC/ERK和NOX4/p38MAPK信号通路来调节T2DM大鼠心房SK2、SK3通道蛋白的表达,以期为阐明糖尿病心房的部分离子通道重构机制以及为糖尿病所致AF的防治提供理论依据。研究方法:健康雄性Wistar大鼠,采用高脂高糖饮食联合腹腔注射小剂量链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)的方法构建2型糖尿病大鼠模型。4周后(空腹一夜)断尾采血测量空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)及空腹胰岛素(fasting insulin,FINS),计算出胰岛素敏感指数(insulin sensitivity index,ISI),同时行腹腔糖耐量实验,筛选出空腹血糖≥11.1mmol/L且伴有ISI降低的大鼠为成模组用于后续实验。对照组(Con,n=8)同步腹腔注射等体积的枸橼酸缓冲液及采血检测FBG及FINS。所有成模大鼠随机分为2组:未经治疗的T2DM组(DM,n=8);二甲双胍治疗组(Met)。Met组给予二甲双胍300mg/kg/d灌胃8周;Con组和DM组均给予等量生理盐水灌胃8周。最后2周,Met组内随机分为以下几组:单纯二甲双胍治疗组(Met,n=8)、腹腔注射PKC激动剂佛波醇(phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA)组(PMA,n=8)、尾静脉注射ERK激动剂重组人表皮细胞生长因子(recombinant human epidermal cell growth factor,rh-EGF)组(EGF,n=8)、皮下注射烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸氧化酶(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase,NOX)抑制剂二苯基氯化碘盐(dibenziodoliumchloride,DPI)组(DPI,n=8)和尾静脉注射p38MAPK激动剂茴香霉素(anisomycin)组(AN,n=8)。PMA组给予腹腔注射PMA[2ug/kg,隔日一次,溶解于二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)中];EGF组给于尾静脉注射rh-EGF(10ug/kg,每日一次,溶解于蒸馏水中);DPI组给于皮下注射DPI(1mg/kg,每日一次,溶解于DMSO中);AN组给于尾静脉注射茴香霉素(5mg/kg,隔日一次,溶解于无菌磷酸盐缓冲液中);Con、DM及Met组分别同步注射等量液体作为对照步骤。最后处死大鼠,快速分离心房组织,小心去除脂肪和疏松结缔组织。采用酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)的方法使用PKC激酶活性检测试剂盒检测相关组别大鼠心房组织PKC的活性。采用实时聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-PCR)的方法检测相关组别心房SK2、SK3、NOX4、p38MAPK和ERK1/2的mRNA表达水平。采用蛋白印迹(Western blot)的方法检测相关组别SK2、SK3、NOX4、pERK、p-p38MAPK蛋白的表达水平。采用免疫组化(immunohistochemistry,IHC)的方法检测相关组别SK2、SK3的蛋白表达水平。结果:1、通过8周的高脂高糖饮食联合腹腔注射小剂量STZ(30mg/kg)的方法可以构建稳定的T2DM大鼠模型,具有2型糖尿病典型的代谢紊乱特征。我们观察到与对照组相比,T2DM模型大鼠的体重(body weight,BW)明显降低(P<0.01);FBG及FINS水平明显升高(P<0.01);经计算得出的ISI较对照组明显降低(P<0.01);腹腔糖耐量实验中的血糖也较对照组明显增加(P<0.01)。综合以上实验结果,可以看出大鼠模型有胰岛素抵抗、血糖升高及糖耐量减低等典型的T2DM特征。2、我们采用RT-PCR的方法检测了Con、DM和Met各组心房组织的SK2、SK3、NOX4、p38MAPK和ERK1/2的mRNA表达水平。相比于对照组,T2DM大鼠心房SK2 mRNA表达明显降低(P<0.01),SK3及NOX4 mRNA表达明显升高(P<0.01),而p38MAPK和ERK1/2的mRNA表达无变化;8周的二甲双胍治疗可明显上调SK2 mRNA的表达(P<0.01)、下调SK3 mRNA(P<0.05)和NOX4 mRNA的表达(P<0.01)。3、采用ELISA的方法检测了Con、DM、Met和PMA各组心房组织的PKC活性水平。采用Western blot和IHC的方法检测了Con、DM、Met、PMA和EGF各组心房组织SK2、SK3和pERK蛋白的表达水平。相比于对照组,DM组大鼠心房PKC活性明显升高(P<0.01),pERK表达明显增加(P<0.01),SK2蛋白表达明显下降(P<0.01),SK3蛋白表达明显升高(P<0.01)。相比于DM组,8周的二甲双胍治疗可明显抑制心房的PKC活性(P<0.01),降低pERK表达(P<0.01),同时上调SK2蛋白表达(P<0.01)、下调SK3蛋白表达(P<0.05)。相比于Met组,尾静脉注射ERK激动剂rh-EGF在明显提升pERK的同时(P<0.01),进一步抑制了SK2蛋白的表达(P<0.05)、提升了SK3蛋白的表达(P<0.01);尾静脉注射PKC激动剂PMA在明显提升PKC活性的同时(P<0.01),同步提升了pERK的表达(P<0.05),进一步抑制了SK2蛋白的表达(P<0.01)、提升了SK3蛋白的表达(P<0.05)。4、采用Western blot和IHC的方法检测了Con、DM、Met、DPI和AN各组心房组织SK2、SK3、NOX4和p-p38MAPK蛋白的表达水平。相比于对照组,T2DM大鼠心房NOX4及p-p38MAPK的蛋白表达明显升高(P<0.01),SK2蛋白表达下降(P<0.01),SK3蛋白表达升高(P<0.01)。8周的二甲双胍治疗显著降低了NOX4及p-p38MAPK的蛋白表达水平(P<0.01),同时上调了SK2蛋白的表达(P<0.01)、下调了SK3蛋白的表达。相比于Met组,尾静脉注射p38MAPK激动剂anisomycin在明显提升p-p38MAPK表达的同时(P<0.01),同时抑制了SK2蛋白的表达(P<0.01)、提升了SK3蛋白的表达(P<0.05);皮下注射NOX抑制剂DPI明显抑制了NOX4的表达(P<0.01),进一步提升了SK2蛋白的表达(P<0.05)、抑制了SK3蛋白的表达(P<0.05),并且同时下调了p-p38MAPK的表达(P<0.01)。结论:1、T2DM大鼠心房SK2通道蛋白发生了下调、SK3通道蛋白发生了上调,二甲双胍可以反向调节SK2、SK3通道蛋白的异常表达。2、PKC/ERK及NOX4/p38MAPK信号通路参与介导了T2DM大鼠心房SK2蛋白的下调、SK3蛋白的上调。3、长期的二甲双胍治疗通过抑制PKC/ERK及NOX4/p38MAPK信号通路部分修复了SK2、SK3离子通道蛋白的重构。