RNA干扰(RNA interference,RNAi)是双链RNA分子引发的序列特异性转录后基因沉默过程。该现象广泛存在于多物种中。RNA干扰所致的同源基因降解现象引起生物学家的广泛关注并将其改造成一种人为的基因阻断技术,用于基因功能的研究。由于长双链RNA分子在哺乳动物细胞能引起非特异性的干扰素反应,RNAi技术的应用最初局限于线虫、果蝇等低等生物。随着siRNA(small interfering RNA)特异性抑制作用的发现,RNAi技术的应用范围延伸到哺乳动物;并且从对单一、特定基因的研究迅速推及全基因组水平的功能研究,以此为契机推动了RNAi文库的构建。　　 现有的哺乳动物细胞RNAi文库有三种:已知基因RNAi文库、来源于cDNA文库的亚随机RNAi文库和完全随机的RNAi文库。已知基因RNAi文库受限于对基因编码序列的认识程度,适用于对某一特殊功能基因群或特定信号通路的研究;来源于cDNA文库的亚随机RNAi文库受限于基因的表达水平和其物种来源,并非完全意义上的随机,特定的某个此类文库只适用于某一特定细胞群或组织的功能基因研究。完全随机的RNAi文库使得真正意义上的全基因组水平功能基因的大规模筛选成为可能。　　 我们选用了本课题组构建的完全随机RNAi文库。此文库的siRNA编码序列位于相向双启动子之间,其中18bp的核苷酸编码序列是化学随机合成的,理论上包括了可以涵盖任意基因的siRNA序列。所用文库的实际多样性是5×107,是目前世界上最大的随机RNAi文库。又因为这一随机RNAi文库是用化学合成的方法获得siRNA的编码序列,其文库不受生物或组织来源以及细胞内基因表达水平的限制。因此可以在一个较宽的生物范围内适用,而且在低水平表达基因的功能研究中将具有更明显的优势,是后基因组时代基因功能研究的有力手段。　　 我们用随机RNAi文库进行了细胞增殖相关基因的筛选研究。RNAi文库表达质粒被稳定转染小鼠MC3T3-E1细胞,在G418的选择压力下连续传代培养60天。这样,由于siRNA的RNA干扰作用,使得某些基因的表达发生改变并影响了细胞的增殖速度。则增殖加快表型的细胞会在连续的细胞传代过程中逐渐得到富集,而增殖速度正常或增殖较慢的细胞在此过程中丢失;从而实现阳性表型细胞的分离。收集筛选结束时的细胞,MTS法检测细胞的增殖速度。实验结果显示转染随机RNAi文库组细胞的增殖速度明显快于阴性对照组细胞,提示文库中的某些siRNA序列确实起到了促进细胞增殖的作用。随后通过PCR——克隆——测序的方法获知这些细胞中所转染的siRNA序列。从中挑取47种siRNA序列的表达质粒重新转染MC3T3-E1细胞,12种siRNA序列的表达质粒表现出一定的促细胞增殖作用。　　 对作用最显著的3个siRNA:clone-A281、B7、B38的Blast同源序列比对发现,B7、B38序列能与5个已知基因的编码区或3′非翻译区部分互补配对(15bp-17bp)。针对这些基因设计新的siRNA序列进行验证实验,在有效siRNA中,针对基因Arhgef5的新的siRNA序列表达质粒转染细胞后仍能促进细胞的增殖。　　 鉴于Blast同源序列比对提供的信息量不够多,下一步用小鼠全基因组芯片分析MC3T3-E1细胞分别转染不同的siRNA序列(A281、B7、B38)表达质粒后基因表达谱的改变,以寻找这些siRNA序列所作用的功能基因(包括非直接的靶基因),从中发现更多与细胞增殖相关的基因。实验结果显示:与阴性对照组相比,siRNA序列不仅影响基因表达谱的改变,而且不同的siRNA序列能引起某些基因发生相同的改变。说明这些受siRNA调节的基因可能与细胞增殖相关。根据人为设定的标准共得到29个表达上调的基因和15个表达下调的基因。而后对部分基因进行功能验证实验,即对表达上调的基因过表达,对表达下调的基因用siRNA特异性抑制其表达之后,得到6个基因(Sdc4、Fosb、Nov、Tmed2、Txndc5、Nr2f2)的过表达能明显促进细胞的增殖,其中Sdc4、Fosb已有文献报道明确与成骨细胞增殖相关,其它基因尚无促进MC3T3-E1细胞增殖的文献报道。　　 综上所述,我们建立了基于细胞功能表型的RNAi文库的筛选方法;用随机RNAi文库成功地进行了大规模筛选,获得了多个与细胞增殖相关的siRNA序列和基因,为细胞增殖机制的进一步研究提供了新的线索;也为后基因组时代提供了高效、快速的功能基因研究平台。