目的:构建一种基于数字微流控（digital microfluidics,DMF）的多样本通量多指标检测装置,进而在此平台完成口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma,OSCC）细胞和巨噬细胞群体水平蛋白分泌的检测分析。材料和方法:本实验首先通过光刻的方法制备了以铬板为基底的DMF芯片底板;之后通过特氟龙修饰氧化烟锡玻璃板制备出用于修饰捕获抗体的基底玻片;同时使用软刻蚀技术制备玻璃板模板,之后将聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane,PDMS）注入模板并进行加热固化和疏水化处理,制备出具有独立多通道的微通道芯片。形成抗体条码玻片（顶板）的过程如下:贴合上述基底玻片和PDMS芯片;借助移液枪和真空泵使捕获抗体充满整个通道并于37℃孵育1小时;封闭、清洗并甩干,于4℃环境内保存、备用（1周内使用）。将DMF芯片的顶板与底板组装后,依次滴加并孵育待测样品、生物素化的检测抗体和别藻蓝蛋白标记的链霉亲合素液滴,达到检测OSCC细胞和巨噬细胞分泌蛋白的目的;之后利用四色激光芯片扫描仪完成顶板扫描、得到图像;最后对扫描结果的荧光信号进行统计分析,在群体细胞水平获得OSCC细胞和巨噬细胞的分泌谱。结果:1.平台的构建:结合多抗体条形码技术以及DMF技术,我们建立了一个用于多重酶联免疫吸附测定的新平台。一方面,利用单层蛋白分子在疏水表面上不可逆吸附的特点,将数十种细胞因子（Cytokines,CK）的捕获抗体条形码锚定在DMF芯片的顶板;另一方面,在DMF芯片的底板上建立了独立驱动电极阵列,单批次最多可容纳十个生物样本。在制备基底玻片顶板过程中,通过使用三甲基氯硅烷疏水化处理PDMS芯片,和在氧化烟锡玻璃板表面与特氟龙层间增设1H,1H,2H,2H-全氟辛基三甲氧基硅烷层,解决了特氟龙剥脱问题;之后通过包被异硫氰酸荧光素标记的牛血清蛋白证明了抗体均匀分布在基底玻片上。此外,我们采用原子力显微镜对固定了捕获抗体的芯片的表面形貌进行了表征,结果显示,在抗体修饰侧和未修饰的特氟龙表面之间有一个清晰的边界,锚定在疏水表面的捕获抗体呈树枝状结构且抗体层厚度为3至6纳米,接近蛋白单分子层的尺寸。2.基于DMF的多指标免疫检测:在成功构建平台后,我们将此DMF全自动免疫分析系统应用于多指标免疫检测。首先对10种不同的蛋白标准品进行了检测,结果显示:（1）典型测量范围为3个数量级;（2）检测限范围从1ng/m L到低于100pg/m L,取决于抗体对的亲和力;（3）芯片检测一致性良好。上述结果证明了使用该平台定量测量这些蛋白质的可行性以及进一步研究生物样品的技术有效性。之后我们利用氢气刺激OSCC细胞并分析其分泌的胞外因子,结果显示,氢气会明显抑制细胞产生促炎CK（如TNF-α、GM-CSF）和趋化因子CCL2、IP-10等,MMP-9和VEGF的分泌也有所下调,这表明氢气环境有助于抑制OSCC细胞的炎性反应。相对的,我们想要探明炎性环境对于免疫细胞是否有促炎或抗炎作用,因此我们利用脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）刺激的巨噬细胞作为研究模型,结果表明,LPS环境会增强巨噬细胞促炎因子的分泌且蛋白质分泌动力学有所不同。CCL2和IL-8蛋白在巨噬细胞孵育过程中,无论是否受到LPS刺激,都会由巨噬细胞主动分泌;LPS刺激可诱导更丰富的CCL3、CCL4和TNF-α分泌;TNF-α在LPS刺激的早期分泌更多,在4小时内达到峰值、8小时后显著减少,而相比之下,CCL4则在12小时后会显著减少。结论:1.结合基于条形码模式的多指标检测技术（其特点是蛋白质测定具有良好的空间分辨率）以及DMF（其特点是可以并行自动操微升大小的单个液滴）,我们建立了一个用于多重酶联免疫吸附测定的新平台,且该平台具有研究生物样品免疫指标的技术有效性。2.氢气发挥抗氧化和抗炎的作用,有助于抑制OSCC细胞的炎性反应。3.LPS炎性环境会增强巨噬细胞促炎因子的分泌,进而引起促炎反应;且随着微环境的改变及细胞基础状态的不同,蛋白质分泌也有所不同。