研究背景:胃食管交界腺癌(adenocarcinoma of esophagogastric junction,AEG)是一种来源于食管远端和胃食管交界处的恶性肿瘤,病死率极高,近年来发病率在全球急剧攀升。尽管内镜筛查手段普及以及多种治疗手段不断更新,胃食管交界腺癌的预后仍然较差,5年生存率约15%-20%。由于位置特殊,胃食管交界腺癌的归属胃癌或食管癌仍有较大争议。1996年Siewert尝试以一种标准化的分类系统解决这一争议性的问题,在解剖标准的基础上,将该肿瘤予以分类,这些肿瘤必须均侵及胃食管交界处(esophagogastric junction,EGJ)。肿瘤中心位于EGJ以上1-5cm为Ⅰ型,肿瘤中心位于EGJ以上1cm至EGJ下2cm以内为Ⅱ型,而肿瘤位于EGJ下2-5cm为Ⅲ型。显然,Ⅰ型AEG代表远端食管癌,Ⅱ型为贲门癌,而Ⅲ型则为贲门周围癌。Barrett食管和食管癌已被证明有比较确定的关系,由于位于食管下端,Ⅰ型AEGs与Barrett食管密切相关,其中80%Ⅰ型AEGs手术切除标本表现为肠上皮化生。相反地,Barrett食管相关肠上皮化生分别见于仅5.6%-8%的Ⅱ型和Ⅲ型AEGs肿瘤患者。而且,在不同人群中,各型肿瘤所占比例有所不同;Ⅱ型和Ⅲ型AEGs肿瘤患者在东方国家发病率较欧美国家高,这种发病率的差异可能与西方国家食管癌发病率增加有关。在美国,26年来,白种男性食管腺癌(esophageal adenocarcinoma,EAC)发病率增加 400%,而白种女性增加 300%。在同一研究中,非洲裔美国男性EAC发病率升高100%,然而鳞癌的发病率却无明显变化。1992年至1998年,Kubo and Corely流行病学研究最终结果表明食管癌发病率上升,而这期间贲门癌发病率稳定。其他有研究表明Ⅱ型和Ⅲ型AEGs发病率略有增加。结合西方国家远端胃癌发病率陡降的数据,以上流行病学证据表明AEGs代表了一种区别于EAC、远端胃癌以及食管鳞癌的异质性肿瘤。在美国癌症联合委员会(American Joint Committee on Cancer,AJCC)第七版分级手册问世之前,AEGs既可以通过食管癌系统分级,亦可应用胃癌分级标准,导致分级混乱,影响其标准化治疗。因此,第七版分级手册致力于解决这一问题,运用食管癌分级系统对AEGs进行分级。典型的食管癌分级流程包括:胸部、腹部及盆腔联合计算机断层扫描(computed Tomography,CT)/正电子发射成像(positron emission tomography,PET)以及内镜超声检查。多个研究表明R0切除仍是AEGs患者获得长期生存的重要预后预测因素。因此,外科治疗首要治疗目标在于彻底切除肿瘤以及相邻肠上皮化生组织,并足够范围的淋巴结清扫。如果术前怀疑无法行根治性切除,则应考虑新辅助化疗。无论进行任何手术,应当于术前充分考虑并改善患者的功能和生理状态,使其达到理想状态。虽然根治性手术治疗是影响AEGs患者预后的主要因素,但由于AEGs在诊断时多已发生广泛局部侵袭或远处转移,仅有11%-%21的AEGs患者可行根治性切除治疗,虽然化疗和/或放射性治疗可起到辅助性治疗作用,但70%患者术后仍出现全身性复发,因此,对于AEGs寻找肿瘤标志物及药物治疗靶点尤为重要。AEGs发生发展机制十分复杂,且受多种通路共同调控,由于调控机制多样,缺少理想的干预药物,而肿瘤播散是一个多步骤的过程,其中细胞外基质的破坏和肿瘤细胞周围结缔组织的降解至关重要。基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinases,MMPs)是一个锌依赖性的肽链内切酶家族,参与细胞外基质的降解,从而促进肿瘤的侵袭及播散。在MMPs家族中,MMP-9和MMP-2是明胶酶,可降解基质内的ⅣV型胶原和明胶。文献显示MMP2和/或MMP9与食管癌侵袭和转移有关。但是,以往研究主要是基于食管鳞状细胞癌(Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC),而这种结论是否适用于不同病理类型的胃食管交界肿瘤仍有争议。组织型基质金属蛋白酶抑制剂(Tissue inhibitors of matrix metalloproteinases,TIMPs)可抑制MMPs的生物学活性,因此其被推测可阻止肿瘤生长、局部侵润及转移。但是相反,报道表明TIMPs又可以刺激生长及抗凋亡的方式促进肿瘤发生。至今,尚缺乏关于TIMPs在人类AEG中的临床意义的研究。因此,本研究旨在通过检测MMP-9和MMP-2及其抑制剂TIMP-1和TIMP-2在胃食管交界腺癌及正常组织中的表达,探讨其表达水平与患者临床病理特征及预后的关系,首次阐明了 MMP-9和MMP-2及其抑制剂TIMP-1和TIMP-2在不同病理类型的胃食管交界腺癌中的表达变化及作用。第一部分MMP-9、MMP-2、TIMP-1和TIMP-2在胃食管交界腺癌中的临床病理研究研究目的:1、研究MMP-9和MMP-2及其抑制剂TIMP-1和TIMP-2表达变化。2、探讨MMP-9和MMP-2及其抑制剂TIMP-1和TIMP-2表达水平与患者临床病理参数的关系。3、探讨MMP-9和MMP-2及其抑制剂TIMP-1和TIMP-2表达水平与患者预后的关系。研究方法:一、胃食管交界腺癌组织中MMP-9和MMP-2及其抑制剂TIMP-1和TIMP-2表达变化1.患者病理标本获取及病理切片制作通过查阅病历记录收集详细的临床及病理资料,获得对应肿瘤组织石蜡包块及癌旁组织标本,并进行病理切片。2.MMP-9和MMP-2及其抑制剂TIMP-1和TIMP-2在肿瘤及正常组织中的表达分布情况采用免疫组织化学染色法(immunohistochemical method)检测MMP-9和MMP-2及其抑制剂TIMP-1和TIMP-2在肿瘤及正常组织中的表达分布情况。结果通过计算染色组织切片Rajkumar得分进行分析。二、统计分析MMP-9和MMP-2及其抑制剂TIMP-1和TIMP-2表达水平与患者临床病理参数的关系。1.分析MMP-9及其抑制剂TIMP-1表达水平与患者临床病理参数的关系。2.分析MMP-2及其抑制剂TIMP-2表达水平与患者临床病理参数的关系。三、统计分析MMP-9和MMP-2及其抑制剂TIMP-1和TIMP-2表达水平与患者预后的关系。1.分析MMP-9及其抑制剂TIMP-1表达水平与患者预后的关系。2.分析MMP-2及其抑制剂TIMP-2表达水平与患者预后的关系。实验结果:一、胃食管交界腺癌组织中MMP-9和MMP-2及其抑制剂TIMP-1和TIMP-2表达变化1.患者病理标本获取及病理切片制作本研究纳入了山东大学附属济南中心医院2006年至2012年之间行外科根治性手术的79例AEGs病人,其中男性40例,女性39例。随访病例70例,随访时间2-62月。通过查阅病历记录收集详细的临床及病理参数资料,并成功获取了患者癌组织及癌周组织标本,顺利制作病理切片。2.MMP-9和MMP-2及其抑制剂TIMP-1和TIMP-2在肿瘤及正常组织中的表达分布情况通过免疫组织化学染色法(immunohistochemicalmethod),我们发现MMP-9和MMP-2阳性染色位于肿瘤细胞的胞质和胞膜。TIMP-1和TIMP-2阳性染色位于肿瘤细胞的胞质和周围基质细胞(图1)。在79例AEGs患者肿瘤组织中,MMP-9、MMP-2、TIMP-1 和 T1MP-2 分别于 52 例(65%),42 例(53%),56 例(70%),39例(49%)患者中高表达。二、统计分析MMP-9和MMP-2及其抑制剂TIMP-1和TIMP-2表达水平与患者临床病理参数的关系。1.分析MMP-9及其抑制剂TIMP-1表达水平与患者临床病理参数的关系。本研究中,MMP-9表达与组织分化差(P=0.001)、淋巴结转移(P=0.007)及UICC分级(P=0.008)有关,但与患者年龄、肿瘤大小、肿瘤侵润深度无关。然而,TIMP-1表达水平与组织分化程度(P=0.001)、淋巴结转移(P=0.007)及UICC分级(P=0.008)呈负有关(表1)。2.分析MMP-2及其抑制剂TIMP-2表达水平与患者临床病理参数的关系。本研究并未发现MMP-2和TIMP-2与病人临床病理参数有显著性联系(表1)。三、统计分析MMP-9和MMP-2及其抑制剂TIMP-1和TIMP-2表达水平与患者预后的关系。1.分析MMP-9及其抑制剂TIMP-1表达水平与患者预后的关系。单因素分析显示淋巴结转移(P=0.002)及肿瘤浸润深度(P= 0.05)与总体生存时间显著相关。MMP-9和TIMP-1表达与总体生存率有关,但无明显统计学意义(P=0.082和P=0.056)。在MMP-9+/TIMP-亚组中,平均生存时间为10.5月,相比其他表型组的平均生存时间35月,其差异与总体生存时间显著相关(P<0.001)(表2)值得注意的是,多因素分析表明,MMP-9+/TIMP-表型与患者预后相关(HR(95%CI):2.263(1.468-2.574),P=0.038)。(表 3)2.分析MMP-2及其抑制剂TIMP-2表达水平与患者预后的关系。本研究并未发现MMP-2和TIMP-2与病人患者预后有显著性联系(表1)结论与创新性:1、MMP-9表达与组织分化差(P=0.001)、淋巴结转移(P=0.007)及UICC分级(P=0.008)有关;2、TIMP-1表达水平与组织分化程度(P=0.001)、淋巴结转移(P=0.007)及UICC分级(P=0.008)呈负有关;3、单因素分析显示淋巴结转移(P=0.002)及肿瘤浸润深度(P= 0.05)与总体生存时间显著相关。4、MMP-9+/TIMP-表型与患者预后相关(HR(95%CI):2.263(1.468-2.574),P=0.038)。第二部分:TIMP1对食管腺癌细胞功能的影响及机制研究目的:本实验通过研究TIMP1对食管腺癌细胞株增殖能力、迁移能力和浸润能力的影响,进一步探讨其对细胞功能影响的可能机制。方法:1.TIMP1基因表达调节:分别通过合成TIMP1的siRNA干扰片段下调TIMP1的基因表达,过表达质粒上调基因表达设计TIMP1的siRNA干扰片段序列,并由上海凯基公司合成。过表达载体GV135-TIMP1由吉凯生物公司合成并进行腺病毒包装。2.调节TIMP1表达后,行食管腺癌细胞株功能学检测(增殖、迁移和浸润能力)siRNA 干扰 TIMP1 表达实验,分组:MOCK(Lipofectamine)组,NC(Lipofectamine+ScramblesiRNA)组 和siRNA-TIMP1(Lipofectamine+siRNA-TIMP1)组。TIMP1 过表达分组:对照组、TIMP1质粒转染组、空载体组。(1)将细胞分别接种于96孔板中,并于Oh、24h、48h、72h时通过MTS法检测细胞增殖率。(2)接种上述各组细胞于12孔板中,均匀划痕,分别于6h、24h和48h观察不同处理组间划痕间距的变化。(3)处理24h后,将细胞转移至Transwell小室中培养6h,分别计数干扰后穿过基底膜的细胞数目。结果:1.分别利用双酶切和测序方法行重组质粒鉴定,结果显示重组质粒基因序列与目的基因一致。2.siRNA-TIMP1干扰TIMP1表达,增加食管腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力,质粒转染上调其表达则出现相反变化。MTS结果显示:在SEG1人食管腺癌细胞中干扰TIMP1后,细胞增殖水平升高(P<0.05);而过表达TIMP1后SEG1细胞的增殖水平下降(P<0.05),各组间差异均有统计学意义。细胞划痕实验显示干扰TIMP1表达后,SEG1细胞愈合能力较NC和MOCK组增强。Transwell结果显示:干扰TIMP1后穿过小室基底膜的SEG1细胞数量最多,较NC和MOCK组差别有统计学意义(P<0.05);而过表达TIMP1后,穿过基底膜的SEG1细胞数目最少,较正常对照组和空载体组差别有统计学意义(P<0.05)。结论:TIMP1在食管腺癌中具有重要作用,干扰TIMP1的表达增加了食管腺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力;上调TIMP1表达后,细胞增殖和侵袭能力下降。