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炎症因子主要是由单核/巨噬细胞或淋巴细胞产生的细胞因子,参与炎症或级联反应,包括IL-1β、1L-6、IL-8、TNF-α等。这些细胞因子参与机体多种疾病的炎症、感染和免疫等多种生理病理过程,可引起脓毒血症、多器官功能衰竭、全身炎症级联反应综合征等。尤其在新冠肺炎中,这些炎症因子引起的细胞因子级联风暴因致死率高被人们广泛认知。然而,炎症反应是由多因子多靶点相互作用形成的复杂级联网络,炎症调节网络是多因子多靶点参与的复杂系统,药物也是通过多靶点多系统发挥抗炎作用,针对炎症网络的整体调节机制现在仍然不清楚。随着研究的深入,人们发现巨噬细胞来源的外泌体与炎症网络的调节密切相关,在炎症调节中发挥着重要作用。外泌体可由各种细胞分泌,是一类细胞外囊泡,在细胞间通讯、免疫应答、抗原提呈、肿瘤侵袭等方面发挥着重要作用,其在疾病诊断和预后的标志物、组织修复及药物递送等领域也有着重要的生物学意义。巨噬细胞来源外泌体携带多种蛋白和遗传信息,可发挥细胞间通讯作用,对炎症过程的发生发展起着重要的信息传递和调控作用。如近年来研究显示外泌体所携带的microRNA参与炎症因子调节网络,既可以调节IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α等多种细胞因子的分泌,也可以被这些炎症因子所调控。目前,外泌体作为炎症反应中细胞间信号传递的新机制,正受到研究者的高度重视。围绕巨噬细胞来源外泌体的研究为解开炎症网络的调控提供了新思路,对揭示药物抗炎作用机制起到重要作用。由于炎症网络的复杂性,寻找合适的抗炎药物一直是研究的热点。大量研究表明中药及其复方可以调整多种细胞因子紊乱和失衡状态,具有良好的抗炎作用。在我们课题组的前期工作中,依托本课题组构建的抗炎中药组分及其复方配伍研究平台,基于高通量液相蛋白芯片技术,结合多药效综合数据分析,通过对多种中药组分的抗炎活性筛选,发现甘草酸（Glycyrrhizic acid,GA）及其组分复方具有强大的抗炎作用,能显著降低巨噬细胞白介素类、趋化因子和肿瘤坏死因子等十多种炎症介质释放。为本论文的研究提供了坚实的前期基础。巨噬细胞来源的外泌体在炎症调节中发挥着重要作用,有望成为抗炎治疗的重要生物标志物和药物研究新靶点,也为进一步揭开炎症网络调节机制提供新的思路和方法。本课题以甘草酸干预巨噬细胞来源外泌体为研究对象,对其影响LPS诱导的巨噬细胞炎症模型分泌细胞因子功能和活化状态进行初步探索,为后续进一步深入研究甘草酸抗炎活性的新作用机制,寻找中药抗炎治疗的新途径和新靶标提供实验研究依据。第一部分:甘草酸抗LPS诱导的RAW264.7细胞炎性损伤的作用研究目的:本实验确定采用无外泌体血清培养复制RAW264.7细胞炎症模型条件,并验证甘草酸抗炎作用。方法:本实验采用超速离心法制备无外泌体血清,采用浓度为1ug/ml LPS药液刺激RAW264.7细胞,通过检测细胞分泌IL-6水平变化,复制RAW264.7炎症细胞模型,甘草酸以400ug/ml的浓度作用24h干预炎症细胞模型,确定甘草酸抗炎效果。结果:在无外泌体血清培养条件下,RAW264.7细胞生长情况良好,可在LPS刺激下诱导形成炎症模型。甘草酸作用后,IL-6水平降低。结论:采用无外泌体血清复制完成RAW264.7炎症细胞模型,LPS诱导剂量为1ug/ml。甘草酸作用浓度为400ug/ml具有明确的抗炎作用。第二部分:甘草酸刺激巨噬细胞来源外泌体制备及鉴定目的:制备甘草酸刺激巨噬细胞来源外泌体及鉴定外泌体方法:本实验采用梯度超速离心的方法分离提纯甘草酸刺激巨噬细胞后分泌的外泌体,并通过透射电镜（TEM）、纳米粒径追踪（NTA）、Western Blot鉴定粒径形态、大小、相关标志蛋白。结果:电镜（TEM）显示粒径形态为典型杯状结构,有双层膜及结构;纳米粒径追踪（NTA）显示所获得粒径大小集中分布在130nm左右;WB结果检测到外泌体标志蛋白CD9,CD63,不含内质网蛋白Calnexin,说明使用梯度超速离心方法可以获得甘草酸干预巨噬细胞来源外泌体。结论:经鉴定所获得颗粒符合外泌体特征,甘草酸刺激巨噬细胞后可以分泌外泌体,且梯度超速离心可以获得纯度较高的外泌体颗粒。第三部分:甘草酸干预巨噬细胞来源外泌体对巨噬细胞功能效应影响目的:研究甘草酸干预巨噬细胞来源外泌体对LPS诱导的巨噬细胞形态功能的影响方法:制备甘草酸干预巨噬细胞来源外泌体（GA-exo）,观察甘草酸干预巨噬细胞来源外泌体（GA-exo）不同剂量对LPS诱导巨噬细胞形态、炎症因子释放及活化状态的影响。Elisa检测相应炎症因子,Western Blot检测巨噬细胞活化指标iNOS。结果:Elisa结果显示,与对照组结果相比,甘草酸干预巨噬细胞来源外泌体（GA-exo）干预LPS诱导的巨噬细胞炎症模型后,细胞上清的IL-6表达下降,有统计学差异,同时巨噬细胞活化指标iNOS相对表达量降低,说明甘草酸干预巨噬细胞外泌体（GA-exo）对巨噬细胞炎症模型有抑制作用。结论:甘草酸干预巨噬细胞外泌体（GA-exo）对巨噬细胞炎症模型有抑制作用,甘草酸抗炎可能是通过外泌体的途径发挥作用。