第一部分含CD：：UPRT融合基因的逆转录病毒表达载体的构建与病毒包装目的：建立含CD：：UPRT融合基因的重组逆转录病毒表达载体，包装含目的基因的重组逆转录病毒。方法：根据逆转录病毒表达载体pLXSN的多克隆位点及pORF5-CD：：UPRT质粒上CD：：UPRT的基因序列，设计PCR引物，在引物的5’端分别引入EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点，采用常规PCR从pORF5-CD：：UPRT中扩增出CD：：UPRT融合基因，经核酸序列测定正确后，分别克隆进入pLXSN和LZRSpBMN-Z。经双酶切鉴定无误后，转染包装细胞PT67和Pheonix，扩大培养阳性克隆，收集上清，获得重组逆转录病毒。结果：重组逆转录病毒表达载体（LZRS-CD：：UPRT）和重组逆转录病毒表达载体（pLXSN-CD：：UPRT）经双酶切后琼脂糖凝胶电泳鉴定，均证明CD：：UPRT基因被克隆入逆转录病毒表达载体。重组pLXSN-CD：：UPRT经上海申能博彩生物科技有限公司序列测定，全长为1227bp的基因，测定结果与原基因序列完全一致。经包装细胞包装收获病毒，得到较高的病毒滴度：LZRS-GFP重组逆转录病毒滴度为2×10⁶CFU／ml，LZRS-CD：：UPRT重组逆转录病毒滴度为2×10⁵CFU／ml。空质粒pLXSN重组逆转录病毒滴度为3×10⁶CFU／ml，pLXSN-CD：：UPRT重组逆转录病毒滴度为1×10⁵CFU／ml。结论：成功构建逆转录病毒表达载体LZRS-CD：：UPRT和pLXSN-CD：：UPRT，收获含CD：：UPRT基因的重组逆转录病毒。第二部分稳定表达CD：：UPRT的C6细胞株的建立与鉴定目的：建立能稳定表达CD：：UPRT的C₆修饰细胞株，为CD：：UPRT联合基因治疗建立研究平台。方法：以含重组质粒pLXSN-CD：：UPRT和空质粒pLXSN的重组逆转录病毒分别转染C6细胞，（加入终浓度为8μg／ml的聚凝胺辅助病毒转染），设立无病毒转染的C6细胞对照组，转染时32℃1000g离心30分钟以提高病毒转染率。转染6小时后更换新鲜培养液，24小时重复转染一次，末次转染后48小时加入终浓度为200μg／ml的G418，筛选14天。筛选14天后对抗性细胞克隆进行扩大培养（培养液10％FCS RPMI1640），所获抗性细胞分别命名为C6-CD：：UPRT和C6-pLXSN，电泳验证各细胞导入基因，并比较C6-CD：：UPRT和原C6的生物学特性。结果：以C6-CD：：UPRT和C6-pLXSN细胞株及未转染基因的C6细胞三种细胞的cDNA为模板，同时加入两套引物进行PCR，结果经1％琼脂糖凝胶电泳，C6-CD∷UPRT除了在1.2Kb处出现明显的特异性目的基因条带之外，在661bp处可见管家基因β-actin的条带，而另外两种细胞（C6-pLXSN细胞株和C6）的PCR电泳结果则仅在661bp处见管家基因β-actin的条带。转基因C6-CD∷UPRT生长传代特性与原C6无明显差异。结论：成功地通过重组逆转录病毒的介导将目的基因CD∷UPRT转导至大鼠胶质瘤细胞株C6中，经传代培养鉴定证明目的基因获得稳定有效表达，C6-CD∷UPRT细胞株传代等生物学特性与原代细胞C6无差异。第三部分CD∷UPRT／5-FC基因治疗方案对胶质瘤细胞C6的杀伤作用及杀伤机理的研究目的：观察CD∷UPRT／5-FC基因治疗方案对修饰C6胶质瘤细胞的杀伤作用，并且探讨可能的杀伤机理。方法：设C6-CD∷UPRT为实验组，C6、C6-pLXSN细胞为对照组，细胞培养过程中加入5-FC（终浓度分别为0、0.1、1、10、100、1000μmol／L），用MTT法测定5-FC对各组肿瘤细胞杀伤效应并计算细胞生长抑制率，免疫组化检测凋亡相关蛋白Fas、Fas-L及Bcl-2的表达、流式细胞仪检测细胞凋亡比例及电镜观察等方面来研究肿瘤细胞杀伤情况。结果：在5-FC的终浓度分别为0.1和1μmol／L时，实验组和对照组的细胞增殖力无差别（P＞0.05），5-FC的终浓度＞10μmol／L时，两组间出现显著性差异，（P值＜0.001）。同时细胞生长抑制曲线显示，5-FC的终浓度为10μmol／L，可使30％的细胞生长受抑制；100μmol／L时，可达63％；当5-FC的终浓度为1000μmol／L，可使75％的细胞生长受抑制，而此剂量的5-FC对未转基因细胞无明显影响。C6-CD∷UPRT细胞经5-FC的作用，出现明显的凋亡峰，且细胞凋亡率与对照组相比具有显著性差异（x²检验P值＜0.005）。C6的Fas、Fas-L及Bcl-2染色均为阳性，转染了CD∷UPRT基因的C6经过5-FC的作用，Fas、Fas-L及Bcl-2染色均为阴性。电镜检测见C6-CD∷UPRT细胞核染色质凝聚并分裂成数块，见典型凋亡小体。结论：CD∷UPRT／5-FC系统在体外对胶质瘤细胞有明显的抑制和杀伤作用，其杀伤胶质瘤细胞的机制可能与凋亡有关，而且可能与Fas、Fas-L及Bcl-2诱导的凋亡有关。第四部分5-FC对裸鼠接种C6-CD∷UPRT肿瘤的治疗作用目的：观察CD∷UPRT／5-FC基因治疗系统对裸鼠皮下胶质瘤的治疗效果。方法：裸鼠皮下种植C6-CD∷UPRT、C6-PLXSN及C6细胞7天后腹腔注射5-FC或PBS液，比较裸鼠生存期及肿瘤大小，用流式细胞仪检测细胞凋亡比例，电镜观察细胞形态变化。结果：各肿瘤细胞皮下注射接种肿瘤至裸鼠背部建立荷瘤动物模型，腹部注射前药5-FC，与对照组相比，试验组瘤体生长速度明显缓慢，肿瘤体积明显小于对照组（p＜0.05）。流式细胞仪的检测也表明C6-CD∷UPRT肿瘤中的肿瘤细胞经5-FC作用后出现明显的凋亡峰，且细胞凋亡率与对照组相比均有显著差异（x²检验P值均＜0.05）。提示动物体内5-FC对C6-CD∷UPRT细胞具有明显的杀伤力并同样有凋亡机制参与。电镜观察发现转基因细胞C6-CD∷UPRT经5-FC作用后出现超微结构变化并有凋亡小体等，进一步证明了CD∷UPRT／5-FC是通过促进C6细胞凋亡而杀伤胶质瘤。结论：CD∷UPRT／5-FC基因治疗方案对裸鼠皮下胶质瘤有明显的杀伤和抑制作用，CD∷UPRT／5-FC对胶质瘤的杀伤作用有凋亡机制的参与。第五部分CD∷UPRT／5-FC联合基因治疗系统对大鼠脑胶质瘤治疗作用的实验研究目的：以大鼠颅内脑胶质瘤模型为基础，观察CD∷UPRT／5-FC联合基因治疗系统对大鼠脑胶质瘤细胞的杀伤作用，以正确评价CD∷UPRT／5-FC联合基因治疗系统对颅内脑胶质瘤的治疗作用。方法：应用立体定向技术种植C6-CD∷UPRT细胞至SD大鼠尾状核，建立颅内胶质瘤荷瘤鼠模型，设立C6-pLXSN和C6细胞为对照组，应用5-FC腹腔注射治疗，观察肿瘤大小、大鼠生存期、电镜观察细胞形态和流式细胞仪检测肿瘤细胞的凋亡指标的变化。结果：各组大鼠接种肿瘤细胞后均有不同程度的进食减少、进攻性减弱、偏瘫，最后濒死前呈恶液质。分别细胞种植后7天和30天开始腹腔注射5-FC(500mg．kg^-1．d^-1)连续治疗10天后，首次治疗10天后实验组大鼠症状开始减轻，体重渐趋上升，大鼠总生存时间明显延长，超过了80天，而对照组平均生存期仅为32天，两组对照有明显差异（p＜0.01）。实验组经5-FC治疗后其肿瘤组织进行流式细胞仪的检测出现明显的凋亡峰，其细胞凋亡率达到了19.36％，与对照组相比有显著差异（p＜0.05），提示凋亡机制参与5-FC杀伤C6-CD∷UPRT细胞的过程。电镜观察进一步发现实验组肿瘤细胞经5-FC作用后出现明显的凋亡小体等，更证明了5-FC／CD∷UPRT联合基因治疗的机理与促进细胞凋亡有关。结论：CD∷UPRT／5-FC联合基因治疗对大鼠颅内脑胶质瘤有明显的抑制和杀伤作用，其机理与促进细胞凋亡有关。第六部分CD∷UPRT／5-FC联合基因治疗系统药代动力学及旁观者效应和作用机理的研究目的：在体外和体内水平直接观察C6-CD∷UPRT细胞内CD∷UPRT双基因表达产物对5-FC作用的药代动力学，并研究CD∷UPRT／5-FC基因治疗系统的旁观者效应和相关机理。建立一种无创、动态、定量的基因治疗观测系统。方法：C6和C6-CD∷UPRT细胞株均用含10％FCS小牛血清的RPMI-1640培养液培养，细胞附壁后更换培养液，同时加入终浓度为1000μmol／L 5-FC继续培养24后终止培养，用核磁共振质谱法（MRS）测定¹⁹F的磁共振磁谱(¹⁹F-MRS)变化，分别检测细胞培养混合成分、细胞和细胞外培养液中氟化物含量。使用¹⁹FMRS质子扫描对荷瘤鼠颅内肿瘤进行体内5-FC药代动力学的测定。将C6-CD∷UPRT及未转染基因的C6细胞按照不同比例混和，C6-CD∷UPRT细胞所占比例分别为：0％、10％、25％、50％、75％、100％。用含终浓度为1000μmol／L 5-FC的RPMI-1640培养液培养4天，MTT法检测OD值计算细胞生长抑制率，进一步计算细胞生存率，绘制细胞生存曲线，进行旁观者效应的观察。将C6-CD∷UPRT及未转染基因的C6细胞按照25％、75％混合细胞接种3×10⁶细胞于25ml培养瓶，至对数生长期更换培养液，加入终浓度为1000μmol／L 5-FC培养24小时后收集细胞培养液进行¹⁹F MRS检测。结果：用1000μmol／L 5-FC培养胶质瘤C6-CD∷UPRT细胞24h后，取细胞悬液和细胞培养液各0.5ml行¹⁹F的磁共振磁谱(¹⁹F-MRS)测定。结果显示在-49.2ppm、-50.6ppm及-45.5ppm均显示3个峰。说明转基因细胞C6-CD∷UPRT中目的基因CD∷UPRT能够有效表达CD、UPRT酶。其中CD高效催化5-FC转化为5-FU，5-FU在UPRT酶的进一步催化下代谢为F-Nuctd直接发挥杀伤胶质瘤细胞的作用。作为限速酶的UPRT直接催化5-FU代谢为F-Nuctd阻断其在自然条件下代谢为β-丙胺酸（无抗肿瘤作用）的代谢途径。¹⁹F MRS检测荷瘤鼠体内5-FC转化作用结果显示：在5-FC腹腔注射后（20min），颅内肿瘤局部MRS即显示强的5-FC波峰及一个较弱的5-FU波峰，随时间的推移，5-FC峰值逐渐减弱，而5-FU信号最高峰值出现在用药后50min左右，在用药157min，两波峰仅留痕迹。而F-Nuctd信号在注射药物后约1小时出现，于118分钟时较为明显，在之后的数小时内增长并且保持峰值相对稳定。旁观者效应观察：当C6-CD∷UPRT细胞比率为10％时，5-FC作用后MTT测得细胞存活率为（79.55±0.88）％，细胞存活率即有差异，随C6-CD∷UPRT细胞比率增大，差异越明显。结论：C6-CD∷UPRT能够有效表达CD、UPRT酶，高效催化5-FC转化为5-FU再进一步代谢为F-Nuctd，直接发挥杀伤胶质瘤细胞的作用。CD∷UPRT／5-FC基因治疗系统最适用于5-FC→5-FU→F-Nuctd药代动力学代谢过程的催化作用，两种自杀基因疗法的互补作用，可大大提高其实用价值。转基因的肿瘤细胞可分泌抗肿瘤活性产物至细胞外，从而抑制和杀伤周围的肿瘤细胞。表现出明显的旁观者效应。¹⁹F-MRS扫描有可能对基因表达的所在部位和产物进行无创、动态和量化分析，从而对CD∷UPRT自杀基因治疗的疗效预测与评估提供客观指标。