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家蚕作为蚕桑产业的重要昆虫,有很多病原都可以感染家蚕,而家蚕微粒子虫是其中最重要的病原之一。家蚕微粒子虫属于微孢子虫大类,也是被划分为真菌界的寄生性病原。微孢子虫的感染范围极广基本能够寄生所有动物,甚至人类。自1857年发现人类历史上第一种微孢子虫—家蚕微粒子虫(Nosema bombycis)以来,迄今为止已有1400多种微孢子虫被鉴定。家蚕通过很多免疫识别分子识别病原,其中有类免疫识别蛋白名为Hemocytin,它可能在家蚕抵御家蚕微粒子虫感染过程中起到关键作用。Hemocytin在家蚕血细胞(颗粒细胞)的颗粒中表达,其能识别病原并启动宿主免疫反应。在这项研究中,我们发现家蚕感染N.bombycis后,Hemocytin的转录和表达量明显上调,表明Hemocytin对N.bombycis的入侵有应答;我们再通过间接免疫荧光检测到Hemocytin能够识别入侵的N.bombycis,并找到了能够与Hemocytin互作的孢壁蛋白25;接着我们分析了Hemocytin识别N.bombycis后可以促进血细胞凝集和黑化,同时也证明了Hemocytin可以抑制N.bombycis的增殖。主要研究结果如下:1.N.bombycis感染后Hemocytin的转录和表达水平上调为了确认Hemocytin对于N.bombycis的入侵有应答,我们取正常和五龄起添食N.bombycis(5×10~4孢子/头)的家蚕血淋巴,从五龄起感染第1天至第6天连续取样,通过相对定量PCR分析表明感染N.bombycis后Hemocytin的转录水平上调。为进一步验证定量结果,我们构建了pET23b-Hemocytin表达载体,纯化得到了Hemocytin活性蛋白,通过注射重组Hemocytin蛋白制备了Hemocytin鼠源的多克隆抗体。接着我们提取1～6天的血淋巴样品蛋白,免疫印迹分析检测到Hemocytin上调表达。上述结果均表明Hemocytin对于N.bombycis的入侵有应答,可能参与了N.bombycis感染的免疫反应。2.家蚕Hemocytin与N.bombycis的相互作用分析为了验证Hemocytin能够识别入侵的N.bombycis。我们观察到Hemocytin能够直接粘附N.bombycis并且对其有一定的凝集作用。为夯实以上结果,我们将原核表达的重组蛋白Hemocytin和N.bombycis共孵育后,IFA结果同样显示Hemocytin能够粘附N.bombycis并且对其有一定的凝集作用。我们推测Hemocytin可能通过病原表面的某些蛋白来识别N.bombycis。基于此,我们鉴定了Hemocytin与N.bombycis表面的哪些孢壁蛋白存在互作,将Hemocytin处理后的N.bombycis样品和未处理的N.bombycis样品进行定量蛋白质组学分析,结果显示孢壁蛋白SWP25表达差异倍数较大,它可能为我们潜在的靶标。接着我们通过酵母双杂交试验证实Hemocytin与SWP25存在相互作用。结果也表明了宿主与病原相互作用的分子基础。3.Hemocytin在启动家蚕细胞免疫中的作用分析为了探索Hemocytin识别入侵的N.bombycis后,引发了下游的哪些免疫反应。我们将Hemocytin蛋白与琼脂糖凝胶珠偶联。首先,我们将珠子与血淋巴一起孵育,在显微镜下观察到Hemocytin孵育过后的实验组血细胞加速凝集和黑化,我们猜测Hemocytin启动的免疫反应可能与包囊和黑化相关。为了验证猜想,我们偶联Hemocytin蛋白到琼脂糖凝胶珠与血淋巴和N.bombycis共孵育,IFA观察到Hemocytin蛋白促进家蚕血淋巴对N.bombycis的包囊和黑化。接下来为了验证Hemocytin启动的免疫反应对N.bombycis感染的重要性,我们利用RNAi技术干涉家蚕体内Hemocytin表达时,我们发现宿主体内N.bombycis的增殖明显增加,相反,我们在个体水平上注射Hemocytin活性蛋白后,免疫印迹以及绝对定量PCR的结果显示宿主体内N.bombycis的增殖明显减少。以上结果均表明Hemocytin识别病原启发的下游反应对病原的感染非常重要,也为进一步探索抵御N.bombycis的新型抗性素材提供参考。