山羊是最早被人类驯化的家畜之一。在茫茫的历史长河中,山羊的养殖记录可追溯到中国的夏商时代。经过劳动人民几千年的精心选择和繁育,中国已经成为世界上山羊品种和资源最为丰富的国家之一。山羊肉不仅是一种健康的食材,同时也是一种中药材。它不仅营养丰富,滋补功效出色,同时还能预防和缓解多种常见疾病。2019年,全国的猪牛羊禽肉产量相比上年减少了10.2%,但山羊肉的产量却增长了2.6%,这些数据表明山羊肉受到越来越多中国人的青睐,人们对于山羊肉的需求量也越来越大。但由于山羊繁殖率偏低导致其规模化养殖受限。因此,增强山羊繁殖率是目前畜牧业的重要课题之一。研究发现,胎盘是母体与胚胎之间氧气运输与营养供给的重要媒介,对于胎儿的生长发育至关重要,并且能够直接影响到出生后胎儿的存活率,是影响动物繁殖性能的重要因素之一。PHLDA2(pleckstrin homology-like domain,family A,member 2,又称为IPL或TSSC3),是一个仅在胚胎或成体胚胎外母系等位基因表达的父源印迹基因,具有调节细胞信号、胞内运输等功能。研究结果显示,在PHLDA2基因功能缺失的胚胎中,胎盘不仅会过度发育,而且糖原存储量会大量增加;在PHLDA2基因过度表达的胚胎中,胎盘的发育迟缓。由此可见,PHLDA2是调节胎盘发育的关键基因,因此对PHLDA2基因展开深入研究对于山羊育种和繁殖有着非常重要的指导意义。本研究是根据实验室已取得的实验结果“PHLDA2基因在山羊胎盘中呈现高表达状态”开展的。实验采集山羊妊娠30天、45天、60天和90天时期胎盘,采用Real-time PCR方法检测不同妊娠阶段山羊胎盘中PHLDA2基因表达情况,并使用Western blot验证PHLDA2基因的表达,构建其基因表达谱;利用亚硫酸氢盐测序检测不同妊娠阶段PHLDA2基因启动子甲基化水平;在山羊滋养层细胞上,使用甲基转移酶抑制剂5-Azacytosine(5-AzaC)验证甲基化对PHLDA2基因表达的影响。构建PHLDA2基因上游启动子不同长度的双荧光素酶表达载体,检测荧光强度,分析PHLDA2基因启动子与其表达的调控关系。最终得到实验结果如下:采用Real-time PCR方法检测PHLDA2基因在妊娠30天、45天、60天与90天时期胎盘中的表达情况。结果显示,45天时胎盘中PHLDA2基因表达量最高,而90天时表达量最低(P<0.05),Western blot的结果进一步支持Real-time PCR结论。从实验室已获得启动子ATG上游1842bp片段中,并没有发现CAAT与TATA框的存在,但在-621/+379预测到CpG岛(island size>100,GC Percent>50.0,Obs/Exp>0.6),由此推测甲基化状态的改变将导致PHLDA2基因表达在不同妊娠阶段表达差异。同时通过在线软件预测发现PHLDA2基因启动子上游端潜在的转录因子结合位点有nuclear factor I-C(NIFC)、the transcription factor ETS proto-oncogene 1(ETS1)、aryl hydrocarbon receptor(AHR)and Ying-yang1(YY1)。为探究PHLDA2基因启动子区域的CpG岛甲基化程度与其表达量的关系,采用亚硫酸氢盐对其进行测序。结果显示,在妊娠45天时,PHLDA2基因表达量达到最高,而PHLDA2基因启动子区域甲基化水平最低。因此我们认为启动子区域甲基化可能调控PHLDA2基因的表达。为了验证此结论,采用甲基转移酶抑制剂5-AzaC处理山羊滋养层细胞,结果显示,随着5-AzaC使用浓度的提高山羊滋养层细胞PHLDA2表达显著提高。通过CpG methyltransferase(M.SssI)处理PHLDA2基因启动子双荧光素酶活性载体,超甲基化PHLDA2启动子双荧光素酶载体活性降低(P<0.05)。为进一步探究PHLDA2基因启动子上游对其表达的调控,我们构建了不同长度的PHLDA2启动子上游双荧光素酶活性载体,并检测到pGL3-420相比阴性对照pGL3-basic质粒双荧光素酶酶活性增加了4倍(P<0.05),pGL3-1023相比pGL3-420双荧光素酶活性显著增加4倍(P<0.05),而pGL3-420到pGL3-598以及pGL3-627双荧光素酶活性没有显著改变,证明pGL3-420到pGL3-1023具有较强转录活性。因此可以推测从-420bp到-1023bp中存在顺式作用元件或反式作用元件结合位点。在-420bp到-1023bp区域预测到可能存在的转录因子结合位点,分别是两个YY1(分别命名为YY1-a和YY1-b)、两个ETS1(分别命名为ETS1-a和ETS1-b)、一个NFIC与一个AHR。我们利用定点突变技术对双荧光素酶载体pGL3-1023进行突变,荧光结果显示pGL3-1023-YY1-ab活性显著增加,而其他突变质粒均无明显变化。为进一步验证YY1对PHLDA2启动子活性的影响,我们又构建了YY1 shRNA与YY1过表达载体,并在山羊滋养层细胞进行验证。结果显示,YY1 shRNA细胞中的PHLDA2表达量是YY1过表达的2倍。同时我们注意到YY1-a结合位点位于CpG岛内,而YY1-b结合位点在CpG岛外,为确定转录因子YY1在哪个位点富集更多,我们用M.SssI对双荧光素酶载体进行体外超甲基化,结果显示,pGL3-1023Me相对于pGL3-1023荧光活性显著降低,而pGL3-1023Me-YY1mut-a相比pGL3-1023Me和pGL3-1023Me-YY1mut-b荧光活性分别升高3倍与1.5倍,表明转录因子在YY1-a结合位点富集更多。另外,染色质免疫共沉淀结果显示YY1在YY1-a富集远多于YY1-b,再次证明转录因子YY1在YY1-a大量结合。YY1 shRNA转染后的染色质免疫共沉淀结果显示,对比NC shRNA,YY1在PHLDA2启动子上的结合减少。而5-AzaC处理山羊滋养层细胞的染色质免疫共沉淀结果也显示YY1在PHLDA2启动子上的结合降低。所有结果都表明YY1结合在YY1-a位置,且可以抑制PHLDA2表达。此外,我们还使用Re-ChIP验证可能与YY1相互作用的HDACs家族蛋白,结果显示YY1与HDAC1和HDAC3蛋白有相互作用,共同抑制PHLDA2基因表达。综上结果,YY1转录因子对甲基化敏感,并与DNA甲基化共同抑制PHLDA2基因表达。