DNA是机体生命活动最重要的遗传物质,DNA损伤则是生物体内经常发生的事件,损伤的类型主要包括DNA氧化和碱基修饰。DNA甲基化归属于DNA碱基修饰这一大类,它对DNA造成的损伤虽然不改变DNA序列,但能导致DNA中共价键的改变,使可遗传的基因表达发生改变,从而影响基因的正常转录和翻译,影响储存遗传信息的载体。DNA甲基化是发现最早的、最基本的,也是研究最多的表观遗传学机制。正常细胞功能的行使有赖于表观遗传的稳态的维持,而大量研究证明DNA不正常的甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变,从而控制基因表达,影响基因的活性和功能,而这些表观遗传的稳态的打乱是与多种复杂疾病以及各类癌症的发病密切相关的。特别是癌症,其发生过程中癌细胞基因组局部区域的超甲基化和整体的欠甲基化是其典型的特征。超甲基化体现在抑癌基因.的启动子区被异常甲基化;而重复序列以及癌基因的启动子区的甲基化程度减小、基因组遗传不稳定性的增加会直接导致整体的欠甲基化。因此,建立快速、灵敏、低成本的检测方法来检测DNA甲基化和甲基转移酶活性,对各类疾病尤其癌症进行早期诊断和治疗,对于提高疾病患者的生存率,具有十分重要的意义。另外,环境中的外源性化合物的侵入,可以直接或间接地作用于DNA造成损伤。如有机磷农药,其广泛地用于农作物的杀虫、杀菌和除草,其特点是化学性质不稳定,在自然界和生物体内易分解;具有基因毒性、细胞毒性和遗传毒性;并且容易在植物性食品,尤其是在水果蔬菜中残留量高,残留时间长。残留的农药通过食物链作用,在人体内累积会引起致畸、致癌、致突变等严重危害,因此许多国家已投入大量的资金、人力和物力用于这方面的研究,并制定愈来愈严格的农药残留限量标准来保障食品的安全生产。因此进一步研发高灵敏的检测有机磷农药残留的分析方法不仅可以严格规范和监督农药的安全使用,也可以促进农药生产工艺的改进和革新。针对上述研究目的,本文利用电分析化学和纳米技术的创新成果构建了检测DNA甲基化、DNA甲基转移酶和有机磷农药的电化学生物传感器,具体研究内容如下:(1)富含胞嘧啶(G)碱基的DNA与捕获DNA和靶向DNA在金电极上形成特异性探针,通过G4联体和血红素构建的HRP模拟酶来催化诱导苯胺聚合生成聚苯胺,从而产生较强的电化学信号。但加入核酸酶后,探针中含有特异序列的双链DNA就会被识别、切割,并进一步被消化,富含G碱基的DNA从电极上脱落。则无法通过G4联体来构建HRP模拟酶,没有酶的催化作用,后续苯胺的聚合不能进行,从而导致电化学信号消失。当双链DNA中的CG位点被甲基化后,会有效抑制核酸酶的识别、切割和消化,则HRP模拟酶催化生成聚苯胺,从而保留了电化学信号。采集到的电化学信号与DNA甲基化程度和甲基转移酶活性直接相关,以此为基础构建的生物传感器对M.SssI甲基转移酶活性的检测限为0.12UmL-1,能对DNA甲基化进行特异性检测,还可用于DNA甲基化抑制剂的相关检测。(2)通过与含有5’-CCGG-3’特定序列的DNA杂交,将探针DNA修饰的金纳米粒子组装在金电极表面,探针DNA可以引发两个发夹DNA交替进行模拟-杂交链反应,从而在电极上形成众多的超长双链DNA,促使电化学指示剂六铵合钌的大量嵌插,从而产生强烈的电化学信号。但未经甲基化的5’-CCGG-3’序列会被特定的核酸酶识别和剪切,从电极上脱落,模拟-杂交链反应就不会被引发,故没有电化学响应;反之,DNA的甲基化会保护该序列不被核酸酶切割,则依然可以采集到强烈的电化学信号。由于金纳米粒子和模拟-杂交链反应的协同作用,使得杂交链反应继续进行,从而电化学信号大大增强,所以本法对M.SssI甲基转移酶的检测限降至0.03 UmL-1,显著提升了传感器的灵敏度,并且方法的特异性和重复性都很好,能用于甲基化抑制剂的检测。(3)利用石墨烯材料表面丰富的亲水基团和独特的二维结构,合成了还原型石墨烯和壳聚糖的纳米复合物,并用其在电极上共价结合乙酰胆碱酯酶构建了纳米生物探针。该探针中酶的生物活性会被有机磷农药所抑制,其抑制作用与农药的浓度相关,由此构建了检测有机磷农药的生物电化学传感器。本方法对亚胺硫磷检测的线性范围为1×10-2μgL-1～5×102μgL-1,检出限为8.J×10-3μgL-1,方法准确度、灵敏度高,并且成本低,便于操作。